Compartimentalización intracelular

Tal y como ya se ha comentado, existe un gran número de moléculas que interaccionan con la PDE4. Algunas de estas moléculas son, en parte, responsables de la localización intracelular de los miembros de esta familia.

Entre los diferentes miembros de la familia PDE4 se han identificado diferencias en el extremo amino responsables de la localización intracelular de cada isoforma (Shakur et al., 1993).

PDE4A

Los primeros estudios que se realizaron para ver el papel de la localización de las PDE fueron con la PDE4A1, que es un enzima asociado exclusivamente a la membrana. La supresión de la región amino de esta isoforma produce una proteína soluble totalmente activa (Shakur et al., 1993; Scotland et al., 1998). Estos estudios sugieren que el papel principal del extremo N-terminal de las PDE es la localización intracelular de estos enzimas. Por otro lado, se ha visto que este mecanismo de asociación a la membrana no es por translocación e inserción en ésta, ya que mutaciones en el extremo amino de la PDE4A1 presentan la misma capacidad de unión a membrana (Smith et al., 1996). Además, estudios con quelantes como el EDTA no liberan este isoenzima de su asociación a la membrana, en cambio el uso de detergentes no iónicos, como Tritón X-100, sí que son capaces de liberar la PDE4A1. Estos estudios sugieren que la unión a membrana es debida a interacciones hidrofóbicas entre el extremo amino de la PDE4A1 y la bicapa lipídica (Houslay, 2001). De hecho se ha descubierto un dominio conservado conocido como TAPAS-1 en la PDE4A1, que, uniendo preferentemente el PA, dirige la inserción de la proteína en la bicapa lipídica mediada por un aumento de iones de Ca2+ (Baillie et al., 2002).

Es muy probable que la PDE4A1 y otras PDE4 largas (como la PDE4A4 y la PDE4A5) formen complejos señalizadores a través de diferentes dominios de señalización,

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puesto que contienen varias regiones conservadas (Pro-Xaa-Xaa-Pro-Xaa-Xaa-Arg) que unen dominios SH3 de ciertas proteínas. La PDE4A4 une preferentemente dominios de la familia Src de tirosina cinasa a través de una interacción dinámica entre la región amino y la LR2, lo que provoca un cambio conformacional en su dominio catalítico que la hace más sensible a rolipram (O'Connell et al., 1996). La PDE4A5 y, tal y como veremos más adelante, la PDE4D4 también interaccionan con estos dominios. El dominio regulador de la PDE4A5 presenta además una secuencia que es reconocida por la caspasa-3, enzima inductor de apoptosis. La sobreexpresión de esta isoforma en células cromafines PC-12 y fibroblastos RAT-1 de rata las protege contra agentes inductores de apoptosis como la staurosporine (Huston et al., 2000). Algunos autores sugieren que la interacción PDE-caspasa3 es importante en la muerte celular y la homeostasis durante el desarrollo del cerebro y del sistema nervioso central (Porter and Janicke, 1999; Cellerino et al., 2000). La PDE4A5 es capaz de interaccionar selectivamente también con la immunofilina XAP2 (Bolger et al., 2003), que forma parte un grupo de proteínas diana de fármacos immunosupresores como la ciclosporina y la rapamicina. El hecho de que la unión PDE-XAP2 inhiba la fosforilación por la PKA, sugiere que esta unión produce un cambio en la estructura terciaria de la PDE, interfiriendo en la interacción de sus dominios UCRs y, por consiguiente, disminuyendo así su actividad (Bolger et al., 2003). Esta isoforma, la PDE4A5, es capaz de localizarse perinuclearmente en células COS-7, posiblemente por la unión de su UCR2 a myomegalin (Verde et al., 2001).

También se ha observado en cultivos celulares, que ciertos inhibidores selectivos de la PDE4 no afectan solamente la actividad catalítica de la PDE4A4, si no que también mediante el cambio conformacional de ésta provocan su redistribución en la célula (Terry et al., 2003).

PDE4B

Se ha determinado la existencia de esta isoforma tanto en la fracción citosólica como en la particulada del cerebro de roedor mediante estudios inmunológicos por análisis Western (Lobban et al., 1994). Estudios de expresión realizados en células COS-7 han corroborado que la localización de las isoformas largas, la PDE4B1 y la PDE4B3, y la isoforma corta PDE4B2 se da tanto en la fracción citosólica como en la no citosólica (Huston et al., 1997), sin embargo, la isoforma larga PDE4B4, que consta de 17 aminoácidos más en la región N-terminal, se distribuye únicamente en el citosol (Shepherd et al., 2003).

Se ha visto que la isoforma corta PDE4B2 puede unirse a la cadena de CD3ε del receptor de linfocitos T donde se activará al ser fosforilada en el residuo Tyr523 (Baroja et al., 1999) o ser reclutada cerca del CD28 de estos linfocitos mediante su interacción con β-arrestina (Baillie and Houslay, 2005; Tasken and Stokka, 2006), y parece estar involucrada en la regulación de la respuesta de estas células inflamatorias (punto ampliado en el apartado 4.7.7.1).

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No existen evidencias claras que puedan determinar la localización intracelular de la PDE4C, ni si está presente mayoritariamente en la fracción citosólica o en la membrana. Esta falta de información podría deberse a la pobre expresión de este isoenzima en la gran variedad de tejidos analizados (Houslay 1998).

Pocos trabajos se han realizado para estudiar la localización intracelular de la PDE4C, pero existe un trabajo en que encuentran que la isoforma PDE4C2 (y la PDE4D3) está ligada a AKAP450 y se localiza en el área centrosomal de las células COS-1 (McCahill et al., 2005). En este trabajo utilizaron la técnica de dominantes negativos, que consistía en sobreexpresar la isoforma a estudiar con una mutación en el centro catalítico que la incapacitase para hidrolizar el AMPc. Como resultado la isoforma mutada (inactiva) sobreexpresada desplazaba a la isoforma endógena (activa) y provocaba un aumento de los niveles de AMPc en la zona que activaban la PKA y ésta hiperfosforilaba la PDE. Se vió que en este caso se activaba la PKA-II y no la PKA-I, proponiendo la existencia del complejo de señalización AKAP450/PKA-II/PDE4C2. PDE4D

Inicialmente se hicieron experimentos en células COS-7 de mono en las que se expresaba de forma transitoria las cinco variantes de splicing humanas de la PDE4D (HSPDE4D1-5) (Bolger et al., 1997). De ellos se reveló que la HSPDE4D1 y la HSPDE4D2 eran isoformas citosólicas, mientras que el resto se encontraban tanto en la fracción citosólica como en la particulada. Las formas largas responden de manera diferente a los tratamientos con diferentes detergentes utilizados para la solubilización de su fracción no citosólica (Houslay et al., 1998).

Las diferencias en el extremo amino entre sus 5 variantes son responsables de su asociación a distintas estructuras subcelulares. Estudios de doble híbrido realizados con la PDE4D3 han identificado una proteína de anclaje, la myomegalin, cuyo extremo carboxilo interacciona con la porción amino de UCR2 de la PDE y que localiza la isoforma en la región perinuclear en Golgi/centrosomal de células de tejido humano y en la región del sarcómero en células de musculatura estriada (Verde et al., 2001). Tal y como ya hemos apuntado en el apartado anterior, la PDE4D3 también interacciona con AKAP450 por la región UCR2 (Tasken et al., 2001; McCahill et al., 2005). Este isoenzima se ha visto además asociado al complejo de señalización formado por mAKAP/PKA/Epac1/ERK5 en la musculatura cardíaca (cardiomiocitos) donde la PDE4D3 hace de adaptador manteniendo ligadas Epac1 y ERK5 a mAKAP y a la vez se encarga de devolver los niveles de AMPc a estado basal, para regular el módulo de señalización de mAKAP (Dodge et al., 2001; Dodge-Kafka et al., 2005).

La isoforma PDE4D5 es capaz de interaccionar con el receptor de la cinasa C activada (RACK1, en inglés receptor for activated c-kinase), que es una proteína de anclaje con una homología relativamente alta con la subunidad β de la proteína G (Gβ) y es capaz

de interaccionar y activar a PKC (Ron et al., 1994; Mochly-Rosen et al., 1995). Se cree que esta interacción es importante en procesos de señalización (Steele et al., 2001; McCahill et al., 2002), debido a la capacidad de RACK1 de interaccionar con Ras- GAP, Src tirosina cinasa, Dynamin-1, la subunidad β de las integrinas, Gβγ y en la

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señalización por adenilato ciclasas (Chang et al., 1998; Liliental and Chang, 1998; Chang et al., 2002; Chen et al., 2004; Chen et al., 2005).

Como ya se ha comentado, las arrestinas son un grupo de proteínas de anclaje que se translocan del citosol hacia los GPCRs e inician el proceso de desensibilización de la señal comenzada por el receptor (Baillie and Houslay, 2005). Un buen ejemplo de esto lo tenemos en la activación de β2-AR (Figura 1.8.), en el que la β-arrestina recluta PDE4D5 hacia el complejo del receptor adrenérgico, donde al disminuir la concentración de AMPc inactiva PKA bloqueándose la vía Gi/ERK, y por lo tanto el efecto de la activación de este sistema.

En este apartado citamos una serie de ejemplos con los que podemos llegar a la conclusión de que la localización de la actividad de PDE explica la señalización compartimentalizada de AMPc por la formación de gradientes de AMPc en la célula que serán descifrados (“read”) a continuación por moléculas PKA unidas a AKAP (Houslay and Adams, 2003).

Gs AC AMPc ATP PKA Unión Agonista β-adrenérgico Receptor β2-Adrenérgico

P

P

P

Figura.1.8. Esquema de la desensibilización del receptor β2-Adrenérgico (modificado de Baillie 2005)