- Se evaluaron experimentalmente diferentes protocolos de enriquecimiento y aislamiento, obteniendo la mayor sensibilidad los protocolos de enriquecimiento con CTSm-8 y ECm, seguidos por el aislamiento en agar MC.
- Se desarrollaron y validaron tres técnicas de PCR para la detección de genes stx, obteniendo un límite de detección de 1×102 UFC mL-1 y 100% de inclusividad y exclusividad, con muestras artificialmente contaminadas
- Se utilizó el protocolo de enriquecimiento-aislamiento validado en el Capítulo I, y las PCR desarrolladas y validadas en el Capítulo II para el análisis de muestras de carne y de ambiente en carnicerías.
- Se determinó la presencia de STEC O157 y no-O157 en carne bovina molida y muestras ambientales de boca de expendio minorista de la ciudad de Berisso, en el marco de un porgrama tendiente a mejorar la calidad de la carne bovina molida.
- Se realizó por primera vez en Argentina un programa piloto que incluyó el diseño estratégico y la aplicación de capacitaciones para manipuladores y mejoras en carnicerías, con base en cuantificación de riesgo y resultados analíticos. El éxito de las mejoras implementadas fue verificado utilizando metodologías desarrolladas y validadas en Argentina.
- Se demostró una disminución significativa en la portación de STEC O157:H7 en las muestras de carne y de ambiente de las carnicerías.
- Luego de implementar las acciones de mejora fue posible demostrar una disminución en la proporción de muestras contaminadas con serotipos de STEC no- O157 reportados en casos de enfermedad en nuestro país.
- No fue posible establecer un vínculo epidemiológico entre los aislamientos de STEC obtenidos en las carnicerías y casos de enfermedad severa en Berisso, debido a que no se registraron casos de SUH en el período de trabajo.
ANEXO
1- Protocolo de extracción de ADN utilizado a partir de caldo de cultivo
Para la extracción de ADN de la muestra a partir de caldo de cultivo, una alícuota de 1 ml se coloca en un tubo tipo eppendorf previamente identificado. Cada tubo se centrifuga a 10000 rpm durante 5 minutos y luego se desecha el sobrenadante. El sedimento celular se resuspende en 150 µl de buffer Tritón X-100 (USB Corporation, Ohio, EEUU) al 1% en buffer TE 1X [10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)]. Luego la mezcla se lleva a 100°C, durante 15 minutos. Posteriormente se centrifuga nuevamente a 10000 rpm durante 5 minutos para sedimentar los restos celulares (Leotta y col., 2005). De esta manera se obtiene un pellet correspondiente al debris bacteriano y un sobrenadante con el ADN. Este extracto de ADN se utilizada como molde en la reacción de PCR.
2- Protocolo de extracción de ADN utilizado a partir de placa
Se toma con ansa en punta material bacteriano del agar de cultivo (colonia aislada o crecimiento confluente) y se coloca en un tubo tipo eppendorf previamente identificado, con 150 µl de buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X [10 mM Tris- HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)]. La mezcla se lleva a 100°C durante 15 minutos. Posteriormente, el tubo se centrifuga nuevamente a 10000 rpm durante 5 minutos para sedimentar los restos celulares (Leotta y col., 2005). De esta manera se obtiene un pellet correspondiente al debris bacteriano y un sobrenadante con el ADN. Este extracto de ADN se utilizada como molde en la reacción de PCR.
3- Condiciones de corrida de la PCR y adquisición de imágenes
Se agregó al ADN amplificado una solución de xilene cyanol 0,25% y glicerol 30% en agua, a razón de 1:5 (solución: ADN), sembrándose 10 µl en un gel de agarosa (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE.UU.) a la concentración recomendada por cada autor en buffer TAE 1X [40 mM tris-acético; 1mM EDTA (pH 8,0)] y adicionado con 0,5 g de bromuro de etidio/ml (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Para la corrida electroforética se utilizó una fuente de poder PowerPac (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Para documentar los geles se utilizó un transiluminador modelo 2000 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y el sistema Olympus C-5060, 5,1 MP (Olympus, Japón). El análisis de los geles se realizó con el programa DIGI Doc-It versión 2.4.0 (UVP, Upland, CA, EE.UU.).
4- Planilla para la cuantificación del riesgo A.- IDENTIFICACIÓN: (Completar con letra clara)
1.- Razón Social:
2.- Establecimiento (Ubicación y Habilitación): 3.- Rubro:
4.- Establecimiento proveedor:
B – EVALUACION: Marcar para cada ítem analizado, en el casillero de “Clasificación”, SI, NO o No Aplicable (N.A) según corresponda que cumpla o no con lo detallada o bien, no corresponda para la actividad auditada.
B.1.- DESCRIPCIÓN
Ítem Descripción Calificación
1 SITUACIÓN Y CONDICIONES DE LA EDIFICACIÓN SI NO N.A
1.1 Ausencia de basura, objetos en desuso, animales, insectos y
roedores, en el área interna y en los alrededores. 4 0 4
1.2
Pisos adecuados:
1.2.1No hay deterioro, se han efectuado las reparaciones necesarias, no hay grietas ni agujeros.
1 0 1
1.2.2. Se encuentra en condiciones de limpieza (sin restos de
comida, no resbaladizos, sin suciedad) 1 0 1
1.3
Cielo rasos y techos:
1.3.1. Sin, grietas, pintura descascarada, etc. (se realizaron las recomendaciones efectuadas),
1 0 1
1.3.2. Sin suciedad, telas de araña, etc. 1 0 1
1.4
Paredes y divisorias:
1.4.1. Permanece el acabado liso, azulejado completo sin faltantes, no hay rajaduras ni grietas. (Se realizaron las recomendaciones efectuadas)
1 0 1
1.4.2. Se encuentran limpias, sin suciedad, materia grasa adherida,
manchas, etc 1 0 1
1.5 Puertas y ventanas:
1.5.1. Se encuentran en buen estado de conservación 1 0 1
1.6
Protección contra insectos y roedores: En todas las aberturas telas mosquiteras, cortinas o puertas con cierre a resorte u otro método indicado por la DIV
4 0 4
1.7 Iluminación: La adecuada según el sector, con protección y de
acuerdo a las indicaciones de la DIV 1 0 1
1.8 Ventilación: Ambiente y temperatura adecuada, no hay olores
desagradables. 1 0 1
1.9
Instalaciones sanitarias:
1.9.1.- Se ajustan a normas del CAA en cuanto a instalaciones. Se realizaron las recomendaciones efectuadas por la DIV
1.9.2.- Limpieza y desinfección adecuada. Hay elementos de higiene personal adecuados. Se realizaron las recomendaciones efectuadas por la DIV
4 0 4
1.10
Vestuarios:
1.10.1.- Se ajustan a normas del CAA en cuanto a instalaciones y ubicación. Se realizaron las recomendaciones efectuadas por la DIV
1 0 1
1.10.2.- Limpieza y desinfección adecuada. Hay armarios en cantidad y otros elementos adecuados. Se realizaron las recomendaciones efectuadas por la DIV
2 0 2
1.11
Lavatorios en el área de manipulación:
1.11.1.- En cantidad, ubicación y condiciones de instalación adecuadas. Se realizaron las recomendaciones efectuadas por la DIV.
2 0 2
1.11.2.- Posee los elementos de higiene personal adecuados y se
encuentra en buen estado de limpieza. 4 0 4
1.12. Abastecimiento de agua potable. 8 0 8
1.13
Tanque de agua:
1.13.1.- Volumen y presión adecuada. Posee tapa. Libre de pérdidas y filtraciones
4 0 4
1.13.2.- En buen estado de limpieza y desinfección cada 6 meses y
documentado 8 0 8
1.14
Destino adecuado de los residuos
1.14.1.- Basura en el interior del establecimiento en recipientes con bolsa y tapa. Restos almacenados adecuadamente para su
recolección posterior.
4 0 4
1.14.2.- Residuos líquidos adecuadamente tratados y arrojados sin
molestar ni dañar al ambiente 2 0 2
1.15
Sector de lavado de equipos y herramientas: Dotados con agua caliente y productos adecuados y que no contamina áreas de procesamiento de alimentos
2 0 2
CB1= Calificación del Bloque 1; TS1= Total de las calificaciones “SI” obtenidas; TNA= Total de las calificaciones “No aplicable” obtenidas; K1= 60 (Constante del Bloque 1); I 1= 10 Importancia del Bloque 1.
Concluida la Auditoría del presente cuadro, se procederá a resolver la ecuación, agregando a la fórmula el total de TS1 y TNA 1
CB1 = ( TS1 x 10 ) / ( 60 – TNA1 )