Wiener lab.
CONDICIONES DE REACCION Tiempo total de reacción: 20 minutos
- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (> 22oC). Si la temperatura ambiente es menor a 22oC, realizar la reac- ción en estufa a 37oC.
- Volumen de muestra: 100 ul
PROCEDIMIENTO
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues- tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el análisis completarlo sin interrupción. Procesar simultáneamente 1 Control Positivo (en el “diente” del extremo derecho del peine) y 1 Control Negativo (en el “diente” del extremo iz- quierdo del peine). Luego proceder de la siguiente forma: Preparación del material:
Colocar 2 gotas de Diluyente de Muestras en cada pocillo a utilizar de la policubeta. En cada uno de estos pocillos colocar 100 ul de Muestra o Controles. Tener la precau- ción de colocar los mismos en el fondo de los pocillos para asegurarse de no producir salpicaduras que puedan contaminar pocillos vecinos. Mezclar aspirando con la
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diente al Control Negativo.
b) El Control Positivo debe ser nítidamente detectable. Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corri- da, empleando un nuevo equipo de reactivos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - El kit está diseñado para usar con muestras puras. No utili-
zar muestras diluidas debido a que las mismas pueden oca- sionar resultados falsos negativos.
- Debe recordarse que la presencia de anticuerpos anti-HIV en el suero NO es diagnóstico de SIDA. Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por métodos de referencia como Western blot.
- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi- ción o infección por HIV.
- Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupus eritematoso sistémico, embarazo, vacunación contra hepa- titis B y otras inmunizaciones, hemodiálisis, enfermedad hepática y otras enfermedades.
PERFORMANCE
- En un estudio conducido por el Global Program on AIDS (GPA) perteneciente a la World Health Organization (WHO) se evaluó un panel de 600 sueros humanos y 8 paneles de seroconversión. Los datos obtenidos se compararon con Western blot como método de referencia, encontrándose una sensibilidad del 100%, una especificidad del 99,7% y una reproducibilidad del 99,4%.
- En un estudio realizado sobre 425 muestras provenientes de pacientes del Instituto de Infectología Emílio Ribas de San Pablo, se obtuvo una sensibilidad del 99,5%, una es- pecificidad del 96,4% y una eficiencia del 97,8%. - En un estudio realizado sobre dos muestras de HIV-1 grupo
O, B7-2705-0001 y JP8-2707-0001, de Boston Biomedica Inc., fueron detectadas las 2 muestras.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Una vez finalizada la prueba y cuando el peine se haya seca- do completamente, observar los resultados sobre una super- ficie blanca, a ojo descubierto y con buena iluminación. Muestra Reactiva: aparición de una mancha coloreada (rosa tenue a rojo) en la zona reactiva del peine. Siempre que este círculo esté presente, aún cuando el color sea de menor in- tensidad que el Control Positivo, indica muestra reactiva. Muestra No Reactiva: no se observa coloración en la zona reactiva del peine.
Toda prueba inicialmente reactiva debe ser ensayada nueva- mente por duplicado. Si uno o ambos de los duplicados son Reactivos, se presume que la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1 o anti-HIV-2.
Si ambos duplicados resultan No Reactivos se considera el primer resultado como falsamente positivo, presumiéndose que la muestra no contiene anti-HIV-1 ni anti-HIV-2. Toda muestra Reactiva debe ensayarse nuevamente emplean- do un método de referencia y realizar la discriminación para HIV-1/HIV-2.
Esquema de interpretación Muestra inicial
zona reactiva incolora zona reactiva coloreada Muestra No Reactiva Muestra Reactiva
Repetir por duplicado
Ambos duplicados Uno o ambos duplicados
No Reactivos Reactivos
Muestra No Reactiva Confirmar por Western blot y discriminar HIV-1/HIV-2
PRESENTACION
Equipo para 48 determinaciones (Cód. 1723201).
BIBLIOGRAFIA
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- Rojkín, L.F.; Lorenzo, L.E.; Beristain, C.N.- Resúmenes 1° Congreso Argentino de Biotecnología, II° Feria Congreso Latinoamericano de Biotecnología, 6-8 junio, 1994, Buenos Aires, Argentina, pag. 70.
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Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica
Producto Inscripto M.S. Cert. Nº: 5181/04
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Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C
SIGNIFICACION CLINICA
El virus de la hepatitis C es el causante del 90% de las hepa- titis no-A no-B que se transmiten por vía parenteral, siendo los principales grupos de riesgo los hemofílicos, hemodializa- dos, homosexuales y drogadictos. La principal característica de la enfermedad causada por este virus es que alrededor del 50% de los pacientes infectados desarrollan hepatitis cróni- ca.
El diagnóstico de la infección se realiza en base a la determi- nación de los anticuerpos anti-HCV. Resulta importante su de- tección no sólo para el diagnóstico de la infección, sino para el control de unidades de donantes en bancos de sangre y para distinguir de otras hepatitis crónicas de etiología desconocida.
FUNDAMENTOS DEL METODO
La muestra se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizada una mezcla de antígenos sintéticos y recombi- nantes conteniendo secuencias de zonas antigénicas de las proteínas estructurales (core) y no estructurales (NS3, NS4 y NS5) del HCV*. Si las muestras de suero contienen los anti- cuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los an- tígenos y permanecerán unidos al soporte. La fracción no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti- inmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, se unirá el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimático y el cromógeno. En los casos en que se haya unido el conjugado habrá aparición de color celeste. La reac- ción se detiene con ácido sulfúrico, virando el color al amarillo.
REACTIVOS PROVISTOS
Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con pocillos conteniendo antígenos sintéticos y recombinantes de hepatitis C, inmovilizados.
Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conju- gadas con peroxidasa.
Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer ci- trato 50 mmol/l pH 3,2.
Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácido clorhídrico 0,1 N.
Stopper: ácido sulfúrico 2 N.
Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l. Diluyente de Muestras: albúmina bovina en solución fisioló- gica tamponada con buffer fosfatos pH 7,2.
Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendo anticuerpos contra HCV.
Control Negativo: dilución de suero no reactivo inactivado.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Buffer de Lavado: para usar diluir 1+4 con agua destilada (una parte de Buffer de Lavado concentrado más cuatro par- tes de agua destilada). A baja temperatura los componentes del reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en baño de agua a 37oC unos minutos mezclando luego por inversión. Diluyente de Muestras: listo para usar. El color del Diluyen- te de Muestras puede variar de lote a lote sin que se afecte la capacidad reaccional del mismo.
Policubeta sensibilizada, Conjugado, Revelador A y B, Stopper y Controles Positivo y Negativo: listos para usar.
PRECAUCIONES
- Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infección. Los controles se encuentran inactivados. Sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo.
- Los sueros controles han sido examinados para HBsAg y HIV encontrándose no reactivos.
- La policubeta se encuentra recubierta con antígenos sintéti- cos y recombinantes de HCV. La posibilidad de contamina- ción con la misma puede descartarse con absoluta certeza. - Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la inactivación de agentes pató- genos. El método recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de dese- cho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (con- centración final 5%) durante por lo menos 60 minutos. - No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes. - No emplear reactivos de otro origen.
- Las policubetas deben incubarse en estufa. No usar baño de agua. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. - Evitar que vapores de hipoclorito provenientes de los reci- pientes para desechos biológicos u otras fuentes entren en contacto con la policubeta, ya que el hipoclorito afecta la reacción.
- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
- Evitar el contacto del ácido sulfúrico con la piel y mucosas. - Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de Lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente. Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con antíge- nos inmovilizados se proveen cerradas al vacío y con dese- cante. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni
ELISA
Hepatitis C (anti-HCV)
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antes que haya tomado temperatura ambiente de lo contrario se favorecerá la humectación del contenido. Las tiras de po- cillos no utilizadas deben conservarse dentro del sobre con el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utiliza- das dentro de los 3 meses posteriores mientras no se supere la fecha de vencimiento del equipo.
MUESTRA Suero o plasma
a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. No deben usarse muestras inactivadas por calor. Ver LIMITACIO- NES DEL PROCEDIMIENTO.
b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis, hiperlipe- mia y otras causas de turbiedad pueden provocar resultados erróneos. Estas muestras se deben clarificar centrifugándolas. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras no diluidas pueden conservarse durante 7 días a 2- 10oC. Para conservación por períodos más prolongados de- ben ser congeladas a -20oC o menos. Evitar los congelamien- tos y descongelamientos reiterados. Existen evidencias que muestran que los congelamientos sucesivos pueden ser cau- sa de resultados erróneos. Si las muestras deben ser trans- portadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envío de materiales infecciosos.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados. - Reloj alarma o cronómetro.
- Estufa a 37oC.
- Espectrofotómetro para lectura de policubetas (opcional).
CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda primaria: 450 nm
- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620-650 nm - Calibración del instrumental: llevar a cero el espectrofotó-
metro con blanco de reactivos, procesándolo de la misma forma que una determinación, pero omitiendo colocar Muestra. - Tiempo de reacción: 90 minutos
- Temperatura de reacción: 37oC y temperatura ambiente - Volumen de muestra: 10 ul
PROCEDIMIENTO
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues- tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el análisis debe completarse sin interrupción.
Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP), 3 Negativos (CN) y los Desconocidos (D). Al depositar la muestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras, debe asegurarse de colocar los mismos en el seno del líquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. En- juagar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillo para asegurar una correcta homogeneización. En los po- cillos a utilizar de la policubeta colocar:
D CP CN
Diluyente de Muestras 200 ul 200 ul 200 ul
Control Positivo - 10 ul -
Control Negativo - - 10 ul
Muestra 10 ul - -
Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos una vez cargadas las muestras correspondientes a cada tira.
En el procedimiento manual, para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en la estufa 30 minutos a 37oC. Luego aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo recibiéndolo en un recipiente para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico. A continuación, lavar 5 veces con Buffer de Lavado em- pleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo.
Después de cada lavado el líquido se descartará también en el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente emplear lavador automático. Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual, invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve presión con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada pocillo:
Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota
En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. En el procedimiento ma- nual, para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar durante 30 minutos en estufa a 37oC. Luego aspirar el líquido de los pocillos, recibiéndo- lo en el recipiente con hipoclorito y lavar según se indicó más arriba.
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líqui- do residual, invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve presión con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada pocillo, respetando el orden:
Revelador A 1 gota 1 gota 1 gota
Revelador B 1 gota 1 gota 1 gota
En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul. Mezclar, aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a tem- peratura ambiente y luego agregar:
Stopper 1 gota 1 gota 1 gota
En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul. Mezclar, aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Leer en espectrofotóme- tro a 450 nm o bicromática a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por comparación con los Contro- les Positivos y Negativos.
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ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable durante 30 minutos, por lo que los resultados deben observarse durante ese lapso.
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA
La corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen- te las siguientes condiciones:
a) Las lecturas de al menos dos de los tres Controles Nega- tivos, corregidas contra el Blanco de reactivos, deben ser me- nores o iguales a 0,150 D.O.
b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0,600 D.O.
Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida. Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sensi- bilidad del aparato empleado.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS a) Con instrumental óptico
La presencia o ausencia de anticuerpos anti-HCV se determi- na relacionando la absorbancia de la muestra respecto al va- lor Cut-off.
Cut-off = CN + 0,150 D.O.
donde CN: promedio de las lecturas del Control Negativo. Zona de indeterminación: Cut-off ± 10%
Muestras reactivas: se consideran aquellas con absorbancias superiores al límite superior de la zona de indeterminación. Muestras no reactivas: se consideran aquellas con absorban- cias inferiores al límite inferior de la zona de indeterminación. Muestras indeterminadas: se consideran aquellas con ab- sorbancias que caen dentro de la zona de indeterminación. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente. Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por du- plicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la misma debe considerarse reactiva.
Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto puede deberse a:
- Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva.
- Contaminación de la muestra durante la dispensación, im- precisión en el dispensado de muestra, conjugado y/o Re- velador en el pocillo.
- Reutilización de tips.
- Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes.
En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este fenómeno pueden ser:
- Contaminación de la muestra durante la extracción, proce- samiento o conservación.
- Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanti- cuerpos, fármacos, etc.
- Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lava- do (sistema obstruido)
b) Interpretación visual
Si se opta por este tipo de interpretación debe considerarse
no reactiva toda muestra que no presente una coloración mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra netamente amarilla se considera reactiva. Colores tenues mayores que el del Control Negativo, requieren la interpreta- ción instrumental.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Constituyen causas de resultados erróneos:
Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.
Contaminación cruzada de muestras no reactivas con anti- cuerpos procedentes de una muestra reactiva.
Contaminación de la solución cromogénica con agentes oxi- dantes (cloro, etc.).
Contaminación del Stopper.
Conservación inadecuada de las tiras de pocillos no utilizadas. Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomienda verificar la limpieza de los recipientes donde se prepara y almacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitado al prepararlo, debe desecharse.
- No utilizar baño de agua para la incubación.
- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi- ción o infección por HCV. La presencia de anticuerpos con- tra el virus C indica infección reciente o pasada por este virus, pero no permite diferenciar entre una infección aguda, crónica o resuelta. Debido al tiempo prolongado que trans- curre entre la infección y la seroconversión, los niveles de anti-HCV pueden ser indetectables en las fases tempranas de la infección.
- Las muestras repetidamente reactivas deberán analizarse por técnicas suplementarias o confirmatorias, como Inmu- noblot o PCR, respectivamente.
- Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromáticas, pueden obtenerse absorbancias negativas que no invalidan la deter- minación. Esto se debe a que algunas muestras dan lectu- ras inferiores al Blanco de Reactivos.
- No utilizar muestras inactivadas por calor ya que pueden ocasionar resultados falsos positivos.
- Verifique que el sistema lavador que Ud. está usando (WIENER WASHER u otro), aspire totalmente el contenido de los pocillos, y que la altura de la solución lavadora dis- pensada sea pareja.
PERFORMANCE
a) Sensibilidad: en un estudio realizado sobre diferentes pa- neles comerciales, se obtuvieron los siguientes resultados: - Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel (PHV 205), Boston
Biomedica, Inc.: se detectaron 23 de 23 muestras positivas. - Anti-HCV Low Titer Performance Panel (PHV 103), Boston Biomedica, Inc.: se detectaron 12 de 14 muestras positivas. - Worldwide HCV Performance Panel (WWHV 301), Boston Biomedica, Inc.: se detectaron 17 de 18 muestras positivas. - Panel 2 HCV, Q Panel Assessoria & Controle de Qualidade:
se detectaron 7 de 7 muestras positivas.
En otro estudio realizado sobre 62 muestras seropositivas según otros métodos ELISA tomados como referencia, se detectaron 61 muestras.
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Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica
Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 193/93 de sueros y plasmas provenientes de bancos de sangre y con-
sultorios externos, la especificidad fue estimada en 99,5%. En una población de 108 individuos hospitalizados y ambula- torios, se encontró una especificidad de 98,1%.
PRESENTACION
Equipo para 96 determinaciones (Cód. 1483251).
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