Con frecuencia, la preparación de la muestra es un área olvidada que durante años ha recibido mucha menor atención que la separación cromatográfica o las etapas de detección. Existen muchas analogías entre los métodos de preparación de la muestra y las separaciones analíticas y, frecuentemente, la etapa de preparación de la muestra puede considerarse como el primer plato teórico en el proceso de separación [28].
El concepto básico de método de preparación de muestra es convertir una matriz real de una muestra en un formato que sea adecuado para el análisis mediante una separación u otra técnica analítica. Esto se puede conseguir empleando una amplia variedad de técnicas, que deben tener en común los siguientes objetivos:
Eliminar los interferentes potenciales (para la separación o las etapas de detección) de la muestra, con objeto de aumentar la selectividad del método.
Aumentar la concentración del analito y, por tanto, la sensibilidad del ensayo.
Si se necesita, convertir el analito en una forma más adecuada para la detección o separación.
Proporcionar un método robusto y reproducible que sea independiente de las variaciones en la matriz de la muestra.
El control de calidad y la seguridad en la cadena alimentaria demandan una metodología apropiada que sea rápida y fácilmente transferible. No se puede olvidar la etapa de muestreo y hay que balancear la posibilidad de utilizar tamaños de muestra más pequeños con la necesidad de que la muestra para análisis sea representativa. Para análisis de alimentos en particular, las técnicas de muestreo
deben ser muy cuidadosas y cualquier porción o alícuota tomada para análisis debe ser representativa de la muestra original total. A veces, es posible utilizar tamaños de muestra pequeños, ya que con objeto de obtener los límites de detección tan bajos requeridos para análisis al nivel de trazas, a menudo se requieren tamaños de muestra relativamente grandes. Tamaños de muestra más grandes se traducen en la necesidad de técnicas de limpieza más eficientes y, por tanto, posiblemente costes superiores. Sin embargo, generalmente, el mayor tamaño de muestra utilizado para la extracción, conduce a resultados más precisos [29].
La optimización de la preparación de la muestra es necesaria no sólo para reducir el tiempo total del análisis sino también porque cada etapa añade una fuente potencial de error. Esto se hace incluso más crítico a las bajas concentraciones requeridas para análisis al nivel de ultratrazas, ya que una proporción significativa de la variabilidad de un método particular, como la reproducibilidad del análisis, disminuye cuando lo hace la concentración.
Con objeto de minimizar la incertidumbre en la preparación de la muestra, es necesario considerar diversos factores. Como estadísticamente la incertidumbre de un método está relacionada directamente con el número de etapas, una reducción en el número de etapas de un método reduce la incertidumbre. Por ejemplo, para compuestos orgánicos volátiles, se requiere la transferencia de los analitos a la fase vapor, posiblemente con una etapa de preconcentración, antes del análisis por GC. Una técnica de extracción más selectiva puede eliminar o reducir la limpieza requerida. El uso de técnicas automáticas también lleva a una reducción de la incertidumbre. Los métodos automáticos generalmente son más reproducibles que los métodos manuales y disminuirán el tiempo de preparación de la muestra que, a menudo, es la etapa más lenta en los procedimientos de análisis.
La obtención de una muestra apropiada es la primera etapa obvia de un procedimiento analítico [30]. El tratamiento de la muestra previo a la extracción es
a menudo determinante en el éxito del procedimiento de aislamiento del analito. Se han estudiado [31] varias combinaciones de tamizado, molienda o pulverización de muestras antes de la determinación de los elementos extractables. Otros autores estudian de forma general [32] los efectos del contenido de agua, temperatura, tiempo, estabilidad y concentración de la muestra. También se ha demostrado [33] que los patrones de partición entre solutos pueden cambiar con la liofilización de las muestras.
Casi todas las técnicas de extracción desarrolladas en los últimos 10–15 años tienen en común la miniaturización. Se ha discutido [34] la relación de los procedimientos de extracción miniaturizados para integrarlos en línea con los sistemas analíticos. Cuando se desarrollan los protocolos analíticos, una etapa clave es la determinación de la recuperación del analito para el método total y para cada procedimiento individual. Así, se establece [35] la diferencia entre el factor de recuperación y la recuperación aparente. También es importante considerar la dependencia de la calibración con la concentración de analito en la muestra y el efecto matriz.
Los límites de residuos legislados para contaminantes en los alimentos están disminuyendo a medida que los gobiernos y los consumidores demandan mejor calidad y estándares más altos, y esto lleva a la necesidad de metodologías más sensibles y útiles. Al mejorar los límites de detección, la evaluación del riesgo en la seguridad de los alimentos es mejor y más robusta, lo que se traduce en una protección mejor para el consumidor.
Los métodos de análisis deben ser suficientemente sensibles para alcanzar no sólo la cantidad de sustancias permitidas por los límites legislados, sino también para detectar sustancias prohibidas, especialmente para compuestos que pueden ser potencialmente genotóxicos o cancerígenos. La evaluación de los riesgos para la salud pública y la seguridad de los alimentos conlleva el empleo de datos fiables y la identificación inequívoca de un analito para que los datos o la evaluación de los riesgos no pueda ser cuestionada.
El uso de MS en análisis instrumental ha permitido la detección de un analito mediante la selección de iones específicos o transiciones. La necesidad de métodos rápidos y universales, que cubran un gran número de compuestos por debajo de los bajos niveles requeridos por la legislación, ha llevado al desarrollo de diferentes extracciones. Por ejemplo, el método QuEChERS para análisis de pesticidas [36] usa volúmenes más bajos de disolvente y poca o nula limpieza. Sin embargo, es todavía importante disponer de procedimientos buenos de extracción y preparación de la muestra, para métodos LC–MS en concreto [37–38].
También es particularmente importante considerar el impacto de los efectos de matriz sobre los sistemas de detección, tales como eficiencia de ionización, ruido del detector y límites de detección y cuantificación, como resultado directo de la preparación de la muestra. Esto es importante sobre todo para la determinación de contaminantes traza en matrices complejas, tales como alimentos [39–40]. El uso de una técnica de limpieza apropiada, como extracción en fase sólida, reduce significativamente las interferencias de la matriz y, por tanto, conduce a una mejora de la relación señal/ruido, permitiendo así la confirmación mediante el espectro de masas y una disminución en los límites de cuantificación. Los beneficios añadidos son que la limpieza de la muestra mejora los cromatogramas y generalmente disminuye el tiempo de mantenimiento del instrumento. Además, el aumento de sensibilidad (menor ruido) en la etapa de detección y la reducción de compuestos interferentes facilita la identificación inequívoca y la confirmación, lo que es particularmente importante cuando se investiga la presencia o ausencia de bajas concentraciones de un analito en matrices de alimentos.
Aunque se utiliza generalmente la cromatografía después de la extracción como técnica de separación, algunas técnicas cromatográficas pueden considerarse como métodos de preparación de muestra. Por ejemplo, la introducción de volúmenes de inyección grandes en una columna fria se puede utilizar como una técnica de preconcentración. Los métodos de fraccionamiento
por GC, LC o Cromatografía de Exclusión por Tamaños/Cromatografía de Permeación en Gel (GPC) se pueden utilizar como técnicas de limpieza. Estos métodos, en los que se recogen fracciones discretas y se transfieren indirecta o directamente al sistema analítico, se incluyen en el ámbito de los métodos hifenados.