Construcción de un árbol AlkB de referencia

Se realizó una búsqueda bibliográfica de clasificaciones de Alcano monooxigenasas de la familia AlkB, para usar como referencia para la clasificación filogenética de las secuencias AlkB obtenidas del metagenoma de sedimentos de Bahía Ushuaia. La mayoría de los trabajos previos fueron realizados con secuencias pertenecientes a los grupos descriptos en los filos Proteobacteria (Heiss-Blanquet, Benoit et al. 2005; Hamamura, Fukui et al. 2008; Wang, Wang et al. 2010; Liu, Wang et al. 2011) y Actinobacteria (Heiss-Blanquet, Benoit et al. 2005; Shen, Young et al. 2010), provenientes de aislamientos (Giebler, Wick et al. 2013) y muestras ambientales (Paisse, Duran et al. 2011; Jurelevicius, Alvarez et al. 2013), incluyendo ambientes marinos (Kuhn, Bellicanta et al. 2009; Wasmund, Burns et al. 2009; Wang, Wang et al. 2010).

Al comparar las secuencias AlkB del metagenoma de sedimentos Bahía Ushuaia con la base de datos de proteínas del NCBI (mediante el algoritmo blastp), observamos que una cantidad importante se encontraba relacionada con secuencias AlkB provenientes de genomas recientemente secuenciados de microorganismos de los filos Bacteroidetes y Proteobacteria, no

incluidas en los trabajos publicados anteriormente. Debido a este hecho, sumado al crecimiento continuo de las bases de datos de genes, decidimos construir un árbol AlkB de referencia actualizado al momento de nuestros análisis. Para ello, se realizó un análisis filogenético a partir de 105 secuencias AlkB de longitud completa, descriptas en las bacterias pertenecientes a los grupos filogenéticos donde el gen alkB se ha reportado en las bases de datos hasta el momento (según nuestro conocimiento). En base a la estructura del árbol obtenido, se definieron 15 grupos de secuencias AlkB con un valor de bootstrap ≥ 77% (Figura 4.3.1). Los promedios de los valores de identidad entre los miembros de dichos grupos estuvieron entre 52% y 73%, a excepción del Grupo VIII-A, que presentó un valor de identidad promedio del 39% entre sus miembros. Los Grupos I a V y el Grupo A+B fueron asignados siguiendo la clasificación propuesta por Wang et al. (Wang, Wang et al. 2010), con modificaciones menores para incluir secuencias nuevas. Los Grupos VI a XIII fueron definidos en este trabajo.

El Grupo A+B incluye secuencias reportadas en bacterias de la clase

Gammaproteobacteria, relacionadas a las dos AlkBs de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (AAG04914 y AAG05962) (Smits, Balada et al. 2002; Smits, Witholt et al.), y a la Alcano monooxigenasa AlkB2 de Alcanivorax borkumensis SK2 (CAL15570) (Hara, Baik et al. 2004). Las hidroxilasas estudiadas de este grupo degradan alcanos desde C6, C8, y C12 hasta C16 (Smits, Balada et al. 2002; Smits, Witholt et al. 2003; van Beilen, Marin et al. 2004; Wang and Shao 2012). El Grupo I está formado por las secuencias AlkB de Alcanivorax dieselolei B-5 (ACZ62808) (Liu, Wang et al. 2011), Alcanivorax hongdengensis A-11-3 (EKF76058), y

Marinobacter sp. ELB17 (EAZ98470). Sólo se ha caracterizado bioquímicamente la enzima de

Alcanivorax dieselolei B-5 (ACZ62808) y se observó que degrada alcanos C6–C16 (Liu, Wang et al. 2011). El Grupo II incluye secuencias reportadas en bacterias de las clases Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria, relacionadas a las Alcano monooxigenasas de

Alcanivorax borkumensis SK2 (AlkB1, CAL18155) (Hara, Baik et al. 2004) y Pseudomonas putida GPo1 (CAB54050) (van Beilen, Smits et al. 2005). Las enzimas estudiadas de este grupo degradan alcanos desde C5 hasta C12 o C13 (van Beilen, Marin et al. 2004; van Beilen, Smits et al. 2005). El Grupo III está formado por dos subgrupos: el primero con secuencias reportadas en bacterias de la clase Gammaproteobacteria, relacionadas a la Alcano monooxigenasa de

Pseudomonas protegens CHA0 (CAB51045) (Smits, Balada et al. 2002); y el segundo con secuencias reportadas en bacterias de la clase Betaproteobacteria, como por ejemplo Ralstonia y

Burkholderia (Marin, Smits et al. 2001). Las enzimas estudiadas del Grupo III degradan alcanos hasta C16, en el rango C6–C16 para la enzima de Alcanivorax dieselolei B5 (AFT72652), y en el rango de C12-C16 para la enzima de Pseudomonas protegens CHA0 (Smits, Balada et al. 2002;

Liu, Wang et al. 2011); como así también alcanos de cadena más larga, en el rango C12-C22 para la enzima de Burkholderia cepacia (Marin, Smits et al. 2001). El Grupo IV está formado por las Alcano monooxigenasas típicamente descriptas en Actinobacteria, como por ejemplo aquellas caracterizadas en Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia y Gordonia (Hamamura, Yeager et al. 2001; Smits, Balada et al. 2002; Whyte, Smits et al. 2002; Fujii, Narikawa et al. 2004). Las enzimas estudiadas de este grupo degradan alcanos desde C10 ó C12 hasta C16, como es el caso de las enzimas de Prauserella rugosa NRRL B-2295, Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Smits, Balada et al. 2002), y Rhodococcus sp. Q15 (AAK97454) (Whyte, Smits et al. 2002). En cambio, la enzima de Gordonia sp.TF6 degrada alcanos C5-C13 (Fujii, Narikawa et al. 2004). El Grupo V está formado por las Alcano monooxigenasas denominadas AlkM, inicialmente caracterizadas en

Acinetobacter (Ratajczak, Geissdorfer et al. 1998; Smits, Röthlisberger et al. 1999; Tani, Ishige et al. 2001; Throne-Holst, Markussen et al. 2006), y su homólogo reportado en Marinobacter hydrocarbonoclasticus (CCG96199) (Grimaud, Ghiglione et al. 2012). Las enzimas estudiadas de este grupo utilizan alcanos C10-C18 (Throne-Holst, Markussen et al. 2006) (Figura 4.3.1).

Con respecto a los grupos definidos en este trabajo, el Grupo VI está compuesto por secuencias AlkBs anotadas en proyectos genómicos recientemente publicados de miembros de la clase Gammaproteobacteria, como por ejemplo Alcanivorax pacificus W11-5 (EKE34662) (Lai and Shao 2012) y Simiduia agarivorans SA1 (AFV00742) (Lin, Shieh et al. 2013). De hecho, las secuencias pertenecientes a los Grupos I, II y VI están relacionadas filogenéticamente, formando un grupo monofilético con un buen soporte (Figura 4.3.1). El Grupo VII está formado por las AlkBs de una gammaproteobacteria identificada como HTCC5015 (EDY86525), Alcanivorax hongdengensis A-11-3 (EKF76059) (Wang and Shao 2012), y Alcanivorax sp. DG881 (WP_007149480). Este grupo se encuentra relacionado filogenéticamente con el Grupo V (Monooxigenasas AlkM). La única enzima estudiada del grupo VII corresponde a la de

Alcanivorax hongdengensis A-11-3, y utiliza alcanos C6-C16 (Wang and Shao 2012). Los Grupos VIII-A y VIII-B contienen AlkBs provenientes de proyectos de secuenciación genómica de miembros de la familia Rhodobacteraceae (Alphaproteobacteria), en su mayoría pertenecientes al clado Roseobacter (Brinkhoff, Giebel et al. 2008), como por ejemplo

Maritimibacter alkaliphilus (EAQ14831), Ruegeria pomeroyi (AAV94629), y Octadecabacter antarcticus (AGI70059). Los Grupos IX a XIII están compuestos por AlkBs provenientes de proyectos de secuenciación genómica de miembros del filo Bacteroidetes. En particular, los Grupos IX y X contienen AlkBs descriptas en miembros del orden Cytophagales. El Grupo XI es más extenso y contiene AlkBs descriptas en miembros de la clase Flavobacteriia. El Grupo XII está formado por las AlkBs de Aquimarinaagarilytica (WP_010178519) y Polaribacter sp.

MED152 (EAQ42349). El Grupo XIII está formado por las secuencias AlkB de Lewinella persica (clase Sphingobacteriia, WP_020569124) y Flavobacterium sp. SCGC AAA160-P02 (clase Flavobacteriia, WP_020080071) (Figura 4.3.1). Según nuestro conocimiento, no se han reportado estudios moleculares o bioquímicos sobre los genes alkB de los grupos VIII a XIII.

Figura 4.3.1. Clasificación de secuencias AlkB de referencia. Árbol filogenético construido a partir de secuencias AlkB representativas de longitud completa, disponibles en la base de datos

del NCBI. El árbol fue construido utilizando el algoritmo Neighbor Joining en el software MEGA 5. Los nombres de las secuencias comienzan con el número de acceso de Genbank. Las Alcano hidroxilasas que poseen estudios de evidencia funcional (mediante expresión heteróloga o inactivación génica) se indican con triángulos grises. Los grupos filogenéticos identificados (Grupos I a XIII y A+B) se muestran en negrita. Los nodos donde se observaron valores de bootstrap ≥ 70 (1000 replicaciones) se indican con círculos negros. Como grupo externo se utilizó la secuencia correspondiente a la subunidad catalítica de la enzima Xileno monooxigenasa (XylM) de Pseudomonas putida (AAA26026). La barra de escala representa 0,2 sustituciones por sitio (20% de distancia) a nivel de aminoácidos.

4.3.2.2 Clasificación de las secuencias AlkB obtenidas del metagenoma de