Construcción de una genoteca de B psychrosaccharolyticus CECT

El banco de DNA genómico de Bacillus psychrosaccharolyticus CECT 4074 en el vector pSU19N se construyó mediante digestión parcial del DNA del microorganismo con la enzima AluI y purificación de los fragmentos de 1, 1,5 y 2 Kb (Figura 28), como se describió en el apartado 5 de Materiales y Métodos.

Las mezclas de ligación de pSU19N con los distintos fragmentos se emplearon para transformar E. coli PAK6. Las células recombinantes se sembraron en medio mínimo suplementado con dGua y Ade (apartado 5.1 de Materiales y Métodos) para llevar a cabo el cribado funcional según su capacidad de producción de guanina. E. coli PAK6 presenta delecionados los dos genes del operón guaBA, que codifican la IMP deshidrogenasa y la GMP sintetasa, y catalizan, respectivamente, la conversión de IMP a xantosina 5’-fosfato y de esta a GMP. Los genes del operón deoCABD también se encuentran delecionados, operón implicado en el catabolismo de nucleósidos para formar gliceraldehído-3-fosfato (Figura 5). De este modo, el GMP, necesario para la supervivencia de E. coli PAK6, sólo puede ser sintetizado a partir de la guanina mediante la guanina fosforribosiltransferasa (gen gpt), es decir, E. coli PAK6 es una cepa auxótrofa para guanina. Por tanto, dGua sólo es fuente de guanina cuando se expresa la actividad nucleósido 2’-desoxirribosiltransferasa en PAK6, sólo pueden crecer aquellas colonias que hayan incorporado un fragmento en el que se encuentre el gen ndt de

Bacillus psychrosaccharolyticus de la desoxirribosa entre dGua y Ade.

Figura 28. A) Representación esquemática de la construcción de la genoteca de

psychrosaccharolyticus CECT 4074 en el vector pSU19N. Las abreviaturas indicadas en el esquema son: CmR (gen que confiere resistencia a cloranfenicol), ori (origen de replicación), MCS (

Site). B) Gel de agarosa 0,8 % con los psychrosaccharolyticus CECT 4074. 1

2- fragmento de 1 Kb, 3- fragmento de 1,

El control, E. coli PAK6·pSU19N, en presencia de dGua y Ade, sólo presentó crecimiento residual (Figura 29 B), que podría ser debido a la actividad de la xantosina fosforilasa (codificada por el gen xapA), enzima que puede llevar a cabo la fosforolísis y la síntesis de desoxi- y ribonucleósidos púricos.

Bacillus psychrosaccharolyticus completo y que por tanto puedan llevar a cabo la transferencia de la desoxirribosa entre dGua y Ade.

Representación esquemática de la construcción de la genoteca de CECT 4074 en el vector pSU19N. Las abreviaturas indicadas en el esquema son: (gen que confiere resistencia a cloranfenicol), ori (origen de replicación), MCS (

8 % con los fragmentos de 1, 1,5 y 2 Kb de DNA genómico de CECT 4074. 1- Marcadores Lambda DNA/Eco91I (BstEII) (Fermentas, Alemania),

fragmento de 1,5 Kb, 4- fragmento de 2 Kb.

PAK6·pSU19N, en presencia de dGua y Ade, sólo presentó crecimiento residual (Figura 29 B), que podría ser debido a la actividad de la xantosina fosforilasa A), enzima que puede llevar a cabo la fosforolísis y la síntesis de y ribonucleósidos púricos.

83 completo y que por tanto puedan llevar a cabo la transferencia

Representación esquemática de la construcción de la genoteca de B. CECT 4074 en el vector pSU19N. Las abreviaturas indicadas en el esquema son: (gen que confiere resistencia a cloranfenicol), ori (origen de replicación), MCS (Multiple Cloning b de DNA genómico de Bacillus (Fermentas, Alemania),

PAK6·pSU19N, en presencia de dGua y Ade, sólo presentó crecimiento residual (Figura 29 B), que podría ser debido a la actividad de la xantosina fosforilasa A), enzima que puede llevar a cabo la fosforolísis y la síntesis de

A)

Figura 29. Crecimiento en medio sólido M9 suplementado con

1 mM A) E. coli PAK 6 transformado con pSU19N que contiene un fragmento de DNA de

psychrosaccharolyticus de 1,5 Kb

Una de las colonias aisladas presentó crecimiento en placa superior al crecimiento residual del control (Figura 29), por lo que se procedió a la purificación del DNA plasmí

secuenciación del fragmento de DNA de

pSU19N empleando para ello los oligonucleótidos RP23 y FP23 (Tabla 4).

Dentro del fragmento de 1,5 Kb se localizó un marco de lectura abierto (ORF) de 444 30,4 % de contenido GC, que codifica 148 aminoácidos (Figura 30).

Esta secuencia se analizó mediante Blast

la pertenencia a la superfamilia glicosiltransferasa (EC 2.4.), dentro de la cual se encu pentosiltransferasas (EC 2.4.2.), y por tanto las nucleósido 2’

2.4.2.6). Además, la secuencia presenta 48 % de identidad con proteínas descritas como glicosiltransferasas.

De acuerdo con la base de datos

catalizan la transferencia de grupos azúcar entre moléculas donadoras activadas y moléculas aceptoras específicas, formando enlaces glicosídicos. La molécula aceptora puede ser un lípido, una proteína, un compuesto heterocíclico o un carbohidrato; y la molécula a transferir puede ser el azúcar de UDP, ADP, GDP o CMP, lo que refleja el amplio rango de actividades

biológicas que presenta esta familia

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml B)

Crecimiento en medio sólido M9 suplementado con Cm (30 µg/mL), dGua y Ade 0,

PAK 6 transformado con pSU19N que contiene un fragmento de DNA de b B) control, E. coli PAK 6 transformado con pSU19N.

Una de las colonias aisladas presentó crecimiento en placa superior al crecimiento residual del control (Figura 29), por lo que se procedió a la purificación del DNA plasmí

secuenciación del fragmento de DNA de B. psychrosaccharolyticus (1,5 Kb) introducido en pSU19N empleando para ello los oligonucleótidos RP23 y FP23 (Tabla 4).

Dentro del fragmento de 1,5 Kb se localizó un marco de lectura abierto (ORF) de 444 30,4 % de contenido GC, que codifica 148 aminoácidos (Figura 30).

Esta secuencia se analizó mediante Blast-P, detectándose un dominio conservado indicativo de la pertenencia a la superfamilia glicosiltransferasa (EC 2.4.), dentro de la cual se encu

pentosiltransferasas (EC 2.4.2.), y por tanto las nucleósido 2’-desoxirribosiltransferasas (EC 2.4.2.6). Además, la secuencia presenta 48 % de identidad con proteínas descritas como

De acuerdo con la base de datos Conserved Domains Database (CDD), las glicosiltransferasas catalizan la transferencia de grupos azúcar entre moléculas donadoras activadas y moléculas aceptoras específicas, formando enlaces glicosídicos. La molécula aceptora puede ser un ína, un compuesto heterocíclico o un carbohidrato; y la molécula a transferir puede ser el azúcar de UDP, ADP, GDP o CMP, lo que refleja el amplio rango de actividades

biológicas que presenta esta familia (Marchler-Bauer et al

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml).

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Cm (30 µg/mL), dGua y Ade 0,3 mM, IPTG PAK 6 transformado con pSU19N que contiene un fragmento de DNA de B.

Una de las colonias aisladas presentó crecimiento en placa superior al crecimiento residual del control (Figura 29), por lo que se procedió a la purificación del DNA plasmídico y a la (1,5 Kb) introducido en

Dentro del fragmento de 1,5 Kb se localizó un marco de lectura abierto (ORF) de 444 pb, con

P, detectándose un dominio conservado indicativo de la pertenencia a la superfamilia glicosiltransferasa (EC 2.4.), dentro de la cual se encuentran las desoxirribosiltransferasas (EC 2.4.2.6). Además, la secuencia presenta 48 % de identidad con proteínas descritas como

(CDD), las glicosiltransferasas catalizan la transferencia de grupos azúcar entre moléculas donadoras activadas y moléculas aceptoras específicas, formando enlaces glicosídicos. La molécula aceptora puede ser un ína, un compuesto heterocíclico o un carbohidrato; y la molécula a transferir puede ser el azúcar de UDP, ADP, GDP o CMP, lo que refleja el amplio rango de actividades

85

atg atg gat ttg aaa tta ttt aca ttt aaa ttc gca gga tcc tat gat 48 M M D L K L F T F K F A G S Y D 16

gaa aat agt aaa tac tat aaa gac ttt aga gat ata tgt aca ttt gtg 96 E N S K Y Y K D F R D I C T F V 32

ggt cat gtg aca aaa gaa gaa att att aat tta tat agg gaa tct gat 144 G H V T K E E I I N L Y R E S D 48

ata ctc gta ttc cct tct tta gca gat gga ttt ggg tta tca gtt tta 192 I L V F P S L A D G F G L S V L 64

gaa gca cta tca ttc ggt att ccc gta att tgt tct gat aat gct ggt 240 E A L S F G I P V I C S D N A G 80

gca agt gat cta atc att aat ggc tac aat ggc tac gtt gtt tca aca 288 A S D L I I N G Y N G Y V V S T 96

ggt gtg gag agc gag ata tat gat aaa tta att tgg ttt aat aat aat 336 G V E S E I Y D K L I W F N N N 112

aga gat aaa ttg caa gag atg agt ata aat gca cga aag agt gca gct 384 R D K L Q E M S I N A R K S A A 128

gaa cta act tgg gag aag tat aat caa aat gta aaa aat gca att aaa 432 E L T W E K Y N Q N V K N A I K 144

aaa ata atg gaa taa 447

K I M E - 148

Figura 30. Secuencia de nucleótidos y aminoácidos del marco de lectura abierto (ORF) contenido en el

fragmento de DNA (1,5 Kb) clonado en pSU19N.

Además, el análisis del alineamiento de la secuencia aminoacídica con las nucleósido 2’- desoxirribosiltransferasas descritas, de las que se conocen los residuos que forman parte del centro activo, con esta secuencia permitieron identificar los residuos que podrían estar implicados en la catálisis, aunque no se observan ni la Gln (Gln46 en LlNDT) ni la Tyr terminal (Figura 31).

86 LfNDT --MKNTDPVAN-TKIYLATSFFNEEQRARIPQALAQLEANPTVGVV--HQPFDFQYKDAR 55 LhPDT --MKAVVPTG---KIYLGSPFYSDAQRERAAKAKELLAKNPSIAHV--FFPFDDGFTDPD 53 LrNDT ---MINQKS-KTVYFCAGWFTDKQNKAYEDAMNAIKANPTVDVENSYVPLQHQYKGLR 54 LlNDT ---MP-K--KTIYFGAGWFTDRQNKAYKEAMEALKENPTIDLENSYVPLDNQYKGIR 51 hBpNDT -MDLKLFTFKF-AGSYDENSKYYKDFRDICTFVGHVTKEEIINLYRESDILVFPS---LA 55 LfNDT VDSDPAGVFGSL--EWQIATYNNDLNAVGTSDVCVALYDMDQIDEGICMEIGMFVALHKP 113 LhPDT EKNPEIGGIRSM--VWRDATYQNDLTGISNATCGVFLYDMDQLDDGSAFEIGFMRAMHKP 111 LrNDT VDEHPE-LLQDR--EWSTATYNGDRVGVSTSDMLLAVYIPEEEDVGMGVELGMARALGKY 111 LlNDT VDEHPE-YLHDK--VWATATYNNDLNGIKTNDIMLGVYIPDEEDVGLGMELGYALSQGKY 108 hBpNDT DGFGLSVLEALSFGIPVI---CSDNAG--ASDLIINGYVVST---GVESEIYDKLIWF-- 105 LfNDT IVLLPFTKKDKSAYEANLMLARGVTTWLEPN-DFSPLKDFNF---NHPMAQPFPPFKVF- 168 LhPDT VILVPFTEHPEKEKKMNLMIAQGVTTIIDGNTEFEKLADYNF---NECPSNPVRGYGIY- 167 LrNDT IMVVIPDE--DFGKPINLMSWG----IADNFIKMSELPNYDF---NKPSYN-FYDGGVY- 160 LlNDT VLLVIPDE--DYGKPINLMSWG----VSDNVIKMSQLKDFNF---NKPRFD-FYEGAVY- 157 hBpNDT -NNNRDKLQEMS---INARKS---AAELTWEKYNQNVKNA—-IKKIME--- 144

Figura 31. Alineamiento con ClustalW de las secuencias de NDTs descritas con la hipotética NDT de B. psychosaccharolyticus. Nucleósido 2’-desoxirribosiltransferasas tipo II de Lactobacillus fermentum

(LfNDT, código acceso GeneBank, gi 52000748), de Lactobacillus reuteri (LrNDT, gi 148544199), de

Lactobacillus leichmannii (LlNDT, gi 9955126), y DRT tipo I de Lactobacillus helveticus (LhPDT, gi

47168984). En gris se encuentran marcados los aminoácidos que podrían formar parte del centro activo en base a los ya descritos para LlNDT y LhPDT (Figura 9).

Aunque la definición de glicosiltransferasa es muy amplia, se decidió clonar el gen en E. coli BL21 (DE3) para su expresión y, mediante un ensayo de actividad, determinar si realmente el gen codificaba una nucleósido 2’-desoxirribosiltransferasa.