Construcción de los mutantes Rv1686c Rv1687c y Rv3161c en M.

Para la obtención de los mutantes se siguió el sistema de transducción especializada descrito en materiales y métodos (apartado 3.4.8).

4.2.1. Mutante del transportador ABC (Rv1686c-Rv1687c)

Para la construcción del AES se amplificó por PCR la región flanqueante 3’ (corriente abajo) del gen Rv1686c con los oligonucleótidos MutUp1Bgl y MutLw1Hin, generando el fragmento 1 (Mut1) de 815 pb que incluye sólo 73 pb de dicho gen. El fragmento 2 (Mut2) fue generado por amplificación de la región flanqueante 5’ (corriente arriba) del gen Rv1687c con los oligonucleótidos MutUp2Xba y MutLw2Stu produciendo un amplicón de 746 pb que incluye sólo 38 pb del gen Rv1687c; de esta forma se omitieron 608 pb del gen Rv1686c de un total de 681 pb y 730 pb del gen Rv1687c de un total de 768 pb (Fig. 4.1). MutUp2Xba MutLw2Stu MutUp1Bgl MutLw1Hin 8687Lw 8687Up 86Up 86Lw Mut 1 815pb Mut 2 746pb Rv1685c Rv1686c Rv1687c mpg

Figura 4.1. Construcción de las deleciones de los genes Rv1686c-Rv1687c.

El fragmento 1 (Mut1) se clonó en el vector pGEM-T®_{, fue secuenciado y no se} observaron cambios en la secuencia. Posteriormente fue liberado digiriendo con las enzimas BglII y HindIII para luego clonarlo en el vector pYUB854 digerido con las mismas enzimas, obteniéndose el vector pYUB854Mut1. El segundo fragmento (Mut2) también fue clonado en el vector pGEM-T®_{; igualmente fue secuenciado y no se} observaron cambios en la secuencia. Este fragmento posteriormente fue liberado por digestión con XbaI y StuI; se hicieron extremos romos y se clonó en pYUB854Mut1 digerido con StuI y tratado con la T4 DNA polimerasa generando el plásmido pYUB854Δ8687. Los fragmentos Mut1 y Mut2 se clonaron en pYUB854 corriente arriba y corriente abajo del gen de resistencia de higromicina respectivamente (Fig. 4.2) La orientación y presencia de la deleción se comprobó por PCR con los oligonucleótidos Hyg out1-8687Up, Hyg out2-8687Lw y por digestión con las enzimas SacI y NotI (Fig. 4.2).

El plásmido pYUB854Δ8687 se clonó en el fásmido phAE159 digiriendo ambos plásmidos con PacI, generando el fásmido phAE159Δ8687. Posteriormente se empaquetó en el fago lambda y se transdujo en E. coli HB101. Los transductantes resultantes se comprobaron por PCR con los oligonucleótidos Hyg out1-8687Up, Hyg out2-8687Lw, 8687Up-8687Lw y por digestión con PacI.

Δ Higromicina BglII StuI XbaI OriE PacI PacI cos HindIII

Mut1

Mut2

res res

Figura 4.2. Clonación y comprobación de los fragmentos Mut1 y Mut2 en pYUB854.

El fásmido phAE159Δ8687 se electroporó en M. smegmatis y luego se preparó un lisado de título elevado que fue transducido en M. tuberculosis. Se hicieron un total de tres transducciones en donde se obtuvieron 38 transductantes de los cuales 12 fueron analizados por PCR con los oligonucleótidos 8687Up-8687Lw que amplifican un fragmento de 1.5 kb en la cepa salvaje y 2.1 Kb en la cepa mutante (Fig. 4.3 carriles 1 y 2), Hyg out1-8687Up que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de 285 pb en el mutante (Fig. 4.3 carriles 3 y 4), Hyg out2-8687Lw que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de 385 pb en el mutante (Fig. 4.3 carriles 5 y 6). Adicionalmente, se amplificó con los oligonucleótidos 86Up-86Lw para diferenciar los recombinantes simples que conservan una copia salvaje del operón y en los que por lo tanto sí hay amplificación, de los recombinantes dobles o mutantes en los que no hubo amplificación. En todas las PCRs se usaron el fásmido phAE159Δ8687 y la cepa H37Rv como controles. Finalmente se confirmaron 5 mutantes (Δ8687 5.31, 5.15, 5.16, 1.14, 1.15).

0.5 kb 1.5 kb 20 kb

MWM 1 2 3 4 5 6

Figura 4.3. Comprobación de la cepa Δ8687 mediante PCR. Electroforesis en agarosa al 1%

de la amplificación por PCR de: H37Rv (carril 1) y Δ8687 (carril 2) con los oligonucleótidos 8687Up-8687Lw, H37Rv (carril 3) y Δ8687 (carril 4) con los oligonucleótidos HygOut1-8687Up,

H37Rv (carril 5) y Δ8687 (carril 6) con los oligonucleótidos HygOut2-8687Lw. El marcador utilizado fue el GeneRuler 1 Kb Plus DNA ladder (Fermentas). Se muestran los resultados para el clon 5.31 como ejemplo de los resultados obtenidos con los otros 4 clones.

4.2.2. Mutante de la dioxigenasa (Rv3161c)

Para la construcción del AES se amplificó por PCR la región flanqueante 3’ (corriente abajo) del gen Rv3161c con los oligonucleótidos Mut61Up1Bgl y Mut61Lw1Hin, generando el fragmento 1 (Mut61-1) de 788 pb que incluye sólo 99 pb de dicho gen. El fragmento 2 (Mut61-2) fue generado por amplificación de la región flanqueante 5’ (corriente arriba) con los oligonucleótidos Mut61Lw2Xba y Mut61Up2Stu produciendo un amplicón de 767 pb que incluye sólo 59 pb del gen; de esta forma se omitieron 991 pb del gen Rv3161c de un total de 1149 pb (Fig. 4.4).

Mut61Lw2Xba Mut61Up1Bgl Mut61Lw1Hin Mut61Up2Stu 3161LwHin _3161UpBam Mut61-1 788pb Mut61-2 767pb PPE53’ Rv3160c Rv3161c Rv3162c

Figura 4.4. Construcción de las deleciones del gen Rv3161c.

El fragmento 2 (Mut61-2) se clonó en el vector pGEM-T®, fue secuenciado y no se observaron cambios en la secuencia; posteriormente fue liberado y digerido con las enzimas StuI y XbaI para luego clonarlo en el vector pYUB854 digerido con las mismas enzimas, obteniéndose el vector pYUB854Mut61-2. El primer fragmento (Mut61-1) fue clonado en el vector pGEM-T®_{, también fue secuenciado y no se} observaron cambios en la secuencia; posteriormente fue liberado por digestión con BglII y HindIII; se hicieron extremos romos y se clonó en pYUB854Mut61-2 digerido con HindIII y tratado con la T4 DNA polimerasa generando el plásmido pYUB854Δ3161. Los fragmentos Mut61-1 y Mut61-2 se clonaron en pYUB854 corriente abajo y corriente arriba del gen de resistencia a higromicina respectivamente (Fig. 4.5). La orientación y presencia de la deleción se comprobó por PCR con los oligonucleótidos Mut61Lw1Hind-Mut61Up1Bgl, Hygout2-Mut61LwHind y por digestión con BamHI y SacI (Fig. 4.5).

El plásmido pYUB854Δ3161 fue clonado en el fásmido phAE159 digiriendo ambos plásmidos con PacI, generando el fásmido phAE159Δ3161. Posteriormente se empaquetó en el fago lambda y se transdujo en E. coli HB101. Los transductantes resultantes se comprobaron por PCR con los oligonucleótidos Hyg out1-3161UpBam y Hyg out2-3161LwHin y por digestión con PacI.

res Higromicina StuI XbaI OriE PacI PacI cos Hyg out2 Hyg out1 Mut61-2 BamHI BamHI BamHI BglII HindIII NruI SacI Mut61-1 3161LwHin 3161UpBam Mut61Up1Bgl Mut61Lw1Hin Mut61Up2Stu Mut61Lw2Xba SacI SacI pYUB854 3161 res Δ

Figura 4.5. Clonación y comprobación de los fragmentos Mut61-1 y Mut61-2 en pYUB854.

El fásmido phAE159Δ3161 se electroporó en M. smegmatis y luego se preparó un lisado de título elevado que fue transducido en M. tuberculosis. Se hicieron un total de dos transducciones en donde se obtuvieron 16 transductantes que fueron analizados por PCR con los oligonucleótidos 3161UpBam-3161LwHin que amplifican un fragmento de 1.1 kb en la cepa salvaje y 2 Kb en la cepa mutante (Fig. 4.6 carriles 1 y 2), Hyg out1-3161UpBam que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de 310 pb en el mutante (Fig. 4.6 carriles 3 y 4) y Hyg out2-3161LwHin que no amplifican en la salvaje y amplifican un fragmento de 354 pb en el mutante (Fig. 4.6 carriles 5 y 6). En todas las PCRs se usaron el fásmido phAE159Δ3161 y la cepa H37Rv como controles. Se confirmaron 11 mutantes (Δ3161 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.21, 2.24, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28).

MWM 1 2 3 4 5 6

0.5 kb 1.5 kb 20 kb

Figura 4.6. Comprobación de la cepa Δ3161 mediante PCR. Electroforesis en agarosa al 1%

3161UpBam, H37Rv (carril 5) y Δ3161 (carril 6) con los oligonucleótidos HygOut2-3161LwHin. El marcador utilizado fue el GeneRuler 1 Kb Plus DNA ladder (Fermentas). Se muestran los resultados para el clon 2.24 como ejemplo de los resultados obtenidos para el resto de mutantes aislados.

El cassette de higromicina tanto de los mutantes del transportador como los de la dioxigenasa no pudo ser eliminado con el plásmido pYUB870 pese a los muchos intentos, lo que dificultó la construcción de cepas dobles mutantes para los dos sistemas.