El clonatge del cDNA de l’isotip hepàtic de porc (PCPT1A), la seva expressió en el sistema heteròleg de Pichia pastoris i la seva caracterització cinètica van descriure aquest enzim com una quimera natural dels isotips A i B. Malgrat la gran similitud entres les seqüències aminoàcides de la CPT1A de porc i les dels seus homòlegs de rata i humà (85.9% i 89.2% respectivament), aquest enzim presenta una afinitat per la carnitina alta (Km=126µM, típica dels
isotips A) i una sensibilitat al malonil-CoA alta (IC50=141nM, típica dels isotips B). La Km per
palmitoïl-CoA és similar a la de la resta de CPT1 descrites. (Nicot et al., 2001). Segons aquests resultats, la CPT1A de porc podia ser un bon model en l’estudi de les relacions estructura-funció de les CPT1 i sobretot, de les regions implicades en la sensibilitat a malonil-CoA.
Fins al moment, els estudis amb proteïnes quimèriques s’havien realitzat combinant CPT1A amb CPT1B (Jackson et al., 2000a/b; Shi et al., 2000; Swanson et al., 1998), però la poca identitat entre les seqüències aminoàcides d’aquestes proteïnes i les diferents característiques
cinètiques que tenien dificultaven molt la interpretació dels resultats. Sovint aquestes quimeres resultaven inactives, probablement per la poca similitud de seqüència. La CPT1A de porc oferia la possibilitat de generar quimeres amb la CPT1A de rata que, presumiblement serien actives per l’elevada identitat entre les dues proteïnes (85.9%).
1.1.- LA REGIÓ C-TERMINAL DE LA CPT1A FUNCIONA COM UN ÚNIC DOMINI
L’ús de quimeres entre la CPT1A de rata (RCPT1A) i la CPT1A de porc (PCTP1A) i la construcció i caracterització cinètica de mutants delecionats en els primers 18 (ǻ1-18) i 28 (ǻ1- 28) aminoàcids de la CPT1A de porc van permetre determinar regions de l’enzim CPT1A importants per la sensibilitat a malonil-CoA. Es van fer cinc construccions quimèriques entre CPT1A de rata i CPT1A de porc: dues intercanviant els extrems carboxils (Porc/Rata i Rata/Porc) i tres substituint regions petites de la zona carboxil de la CPT1A de rata per la zona corresponent de la CPT1A de porc (Rata/Porc-A; Rata/Porc-B i Rata/Porc-C). Els cinc enzims eren actius i presentaven afinitats pel palmitoïl-CoA i la carnitina equivalents a les dels enzims salvatges, indicant un plegament a la membrana i una disposició del centre actiu similars a les proteïnes naturals.
Pel que fa la sensibilitat al malonil-CoA, les construccions quimèriques Porc/Rata i Rata/Porc mostraven valors de IC50 que corresponien a l’enzim del qual tenien l’extrem C-terminal, indicant
que és aquesta regió de la proteïna la que marca el grau de sensibilitat a malonil-CoA de l’enzim. Aquests resultats concordaven amb els estudis publicats amb construccions quimèriques entre CPT1A de rata i CPT1B humana o de rata (Jackson et al., 2000; Shi et al., 2000; Swanson et al., 1998).
D’aquestes construccions es va analitzar, també, la mobilitat electroforètica en un gel SDS- PAGE. Com que les proteïnes CPT1B de rata i humana i la CPT1A de porc migren en un gel de poliacrilamida anòmalament ràpid (segons un pes aparent de 82KDa) (Zhu et al., 1997a/b; Esser et al., 1996; Nicot et al., 2001), i mantenen aquesta característica transcrites i traduïdes in vitro, era de preveure que aquest fenomen fos degut a diferències intrínseques de la seqüència primària d’aquestes proteïnes. L’anàlisi per Western Blot de les construccions quimèriques Porc/Rata i Rata/Porc va mostrar que és la regió C-terminal la que determina la mobilitat electroforètica de les CPT1. Aquests resultats porten a pensar que les diferències en la
seqüència primària d’aquestes proteïnes fan que adoptin una conformació resistent a la desnaturalització per SDS que pugui ser la causa de que migrin segons un pes aparent menor.
En el cas de les construccions quimèriques Rata/Porc-A; Rata/Porc-B i Rata/Porc-C, la substitució d’una petit fragment de la CPT1A de rata pel corresponent de la CPT1A de porc (92, 370,183 aminoàcids respectivament) va ser suficient per conferir una alta sensibilitat al malonil- CoA a l’enzim parenteral.
Aquestes observacions suggereixen que: (I) cap de les regions substituïdes, A, B o C és, per ella mateixa, única responsable del grau de sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA de l’enzim. La substitució de qualsevol d’aquestes regions de la RCPT1A per la corresponent de la PCPT1A genera enzims amb una sensibilitat a malonil-CoA similar a la de la proteïna CPT1A de porc salvatge, indicant que l’extrem C-terminal de les proteïnes CPT1A es comporta com un únic domini que dicta la sensibilitat a malonil-CoA de l’enzim. (II) Cap de les proteïnes quimèriques estudiades té una sensibilitat a malonil-CoA intermitja entre les proteïnes parenterals (PCPT1A i RCPT1A). Totes es comporten com una de les salvatges, indicant que la regió C-terminal de les CPT1A pot adoptar dues estructures diferents, una estructura de baixa sensibilitat a malonil-CoA i una d’alta sensibilitat. L’estructura d’alta sensibilitat sembla més susceptible de canviar a l’estructura de baixa sensibilitat.
La descripció de la regió C-terminal com un únic domini concorda amb els estudis de proteòlisi sobre mitocondris intactes de fetge de rata publicats. Aquests estudis mostren que el tractament amb tripsina/quimiotripsina de la proteïna CPT1A unida a membrana porta a una ràpida disminució de l’activitat CPT1, efecte que és parcialment revertit pel malonil-CoA. En presència de malonil-CoA, l’enzim roman actiu tot i alliberar un fragment de 8Kda que els autors conclouen que no és essencial per l’activitat catalítica de l’enzim (Esser et al., 1993b). Utilitzant els coneixements que ara es tenen sobre l’estructura de la CPT1A i els nostres resultats podem dir que els 8KDa alliberats després del tractament amb tripsina/quimiotripsina corresponen a l’extrem N-terminal de la CPT1A (aproximadament els primers 70 aminoàcids). Algunes publicacions mostren que la CPT1A és resistent a digestions proteolítiques amb concentracions baixes de proteases que no alterin la membrana, suggerint que la CPT1A, especialment la regió C-terminal, es troba fortament ensamblada (Fraser et al., 1997; Cohen et al., 1998).
Estudis previs a aquest treball correlacionaven l’elevada sensibilitat a malonil-CoA de les CPT1B i de la CPT1A de porc amb la migració anòmala en un gel SDS-PAGE (Zhu et al., 1997a/b; Nicot et al., 2001; Esser et al., 1996). Les quimeres Rata/Porc-A i Rata/Porc-C indiquen el contrari. Les dues mostren una sensibilitat a malonil-CoA alta i un patró de migració electroforètica normal, demostrant que l’estructura primària de l’enzim juga un paper en la determinació de la sensibilitat a malonil-CoA, independent del seu paper en l’estructura global de la proteïna.
1.2.- EL DOMINI C-TERMINAL DETERMINA LA SENSIBILITAT A MALONIL-CoA A TRAVÉS D’INTERACCIONS AMB L’EXTREM AMINO
Les dues construccions de CPT1A de porc delecionades en els aminoàcids 1-18 (ǻ18Porc) i 1-28 (ǻ28Porc) i les dues construccions amb les mateixes delecions a partir de la quimera Porc/Rata van donar lloc a enzims molt insensibles a malonil-CoA (IC50 de l’ordre de 100 µM),
però amb diferències estadístiques entre ǻ18Porc o ǻ18Porc/Rata i ǻ28Porc o ǻ28Porc/Rata, sent aquestes últimes menys insensibles (més sensibles).
El fet que ǻ18Porc fos més sensible a malonil-CoA que ǻ28Porc evidencia que l’extrem N- terminal de la CPT1A de porc conté, com en el cas de la CPT1A de rata (Jackson et al., 2000a/b), un determinant positiu (aminoàcids 1-18) i un determinant negatiu (aminoàcids 19-28) per la sensibilitat a malonil-CoA. Malgrat la CPT1A de porc és molt sensible a la inhibició per malonil-CoA, com els isotips musculars que no presenten el determinant negatiu, la seva regió N- terminal sembla funcionar com la de les CPT1A poc sensibles al malonil-CoA.
Per altra banda, mentre que la CPT1A de porc i la quimera Porc/Rata presentaven diferent sensibilitat al malonil-CoA, la deleció dels 28 primers residus aminoàcids d’aquestes construccions va donar lloc a enzims, ǻ28Porc i ǻ28Porc/Rata, amb similar sensibilitat a malonil- CoA. Això indica que el primers 28 aminoàcids de la proteïna determinen les diferències en la sensibilitat a malonil-CoA entre la CPT1A de porc i la CPT1A de rata. El mateix resultat s’observa quan només els primers 18 residus aminoàcids són delecionats (ǻ18Porc i ǻ18Porc/Rata), suggerint que aquests primers 18 aminoàcids N-terminals són suficients per determinar aquestes diferències entre porc i rata.