Criopreservación de Progenitores Nerviosos

La criopreservación del tejido nervios es una técnica tradicional que se suele usar para un posterior trasplante o cultivo tisular [99]. La habilidad de criopreservar un tejido nervioso de la forma más correcta posible nos proporcionaría muchos beneficioso clínicos y en la propia actividad investigadora. Así por ejemplo, nos permitiría aumentar el tiempo del cual se dispone para testar la seguridad y funcionalidad de las células antes del trasplante; aumentar los tiempos de almacenaje. Poder usar siempre los mismo tipos de células para los ensayos; y disminuir la frecuencia de disección para obtener células suficientes con la que se puedan realizar los trasplantes [100].Teniendo en cuenta estos factores, y dado el interés que tienen los precursores GABAérgicos para su uso como tratamiento de diversas enfermedades, tales como las epilepsia y mas concretamente las EI, la criopreservación de estos precursores sería un gran avance en el ámbito de la terapia celular. Cabe recordar, como ya hemos dicho con anterioridad, que no existe ningún método, ni se conocen las condiciones necesarias para la criopreservación de los precursores GABérgicos de la MGE.

Actualmente existen dos métodos que son los más utilizados para la congelación de las CM embrionarias[98], las cuales cuentan con propiedades similares a los progenitores GABAérgicos. Estos son: la criopreservación por congelamiento lento, donde las células son criopreservadas como agrupaciones, o in toto, en donde se conservan las señales paracrinas que les ayuda a su mejor criopreservación, aunque tiene el inconveniente de que se puedan formar cristales intracelulares si la criopreservación no se realiza con un crioprotector; y por otro lado la criopreservación por vitrificación[97], que consiste en la solidificación de un líquido sin la formación de hielo ni cristalización, pero que presenta problemas de posible contaminación microbiológica, logísticos de almacenamiento y transporte, por lo que su aplicación para el congelamiento de CM embrionarias ha sido descartada. Otros parámetros que influyen en la viabilidad de las CM embrionarias han sido la velocidad de congelamiento y la temperatura final de almacenamiento, observándose que la mayor viabilidad se produce a temperaturas de almacenaje de -80ºC

42 [100]. Los resultados obtenidos han mostrado que las células neuronales embrionarias son buenas candidatas para ser criopreservadas y que, aunque los resultados obtenidos por este grupo mostraron niveles de supervivencia muy bajas (aproximadamente 30% de supervivencia post-criopreservación), las células que sobrevivían tenían una morfología típicamente neuronal después de 48 horas en cultivos tras su descongelación [96-98, 100] Por otro lado la utorrenovación in toto de neuronas GABAérgicas procedentes de la corteza han mostrado no influir en la adquisición de la misma morfología al descongelarse que las cultivadas in fresco [101].

Basándonos en los antecedentes descritos pretendemos en esta tesis obtener y poner a punto un procedimiento adecuado de criopreservación para las células procedentes de MGE, que nos permita tener células viables después de la criopreservación, manteniéndose las propiedades de migración, proliferación y diferenciación en los cultivos posteriores, y que puedan tener aplicación para terapia celular, ya que en la actualidad, no se conoce ningún tipo celular que haya sido capaz de llegar a semejante integración y funcionalidad al ser transplantado en el cerebro.

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Hipótesis

44 Las encefalopatías infantiles, así como las enfermedades neurológicas y psicomotrices, que se dan en menores suelen presentar una alta resistencia a los fármacos, o bien las drogas empleadas conllevan numerosos efectos secundarios y una alta toxicidad. Por ello, se hace necesario otro tipo de estrategia que nos permita tratar este tipo de enfermedades de una manera más eficaz. En este punto es donde entra la terapia celular con precursores GABAérgicos procedentes de la MGE, y con la presente Tesis queremos trasmitir un nuevo enfoque de cómo luchar contra estas enfermedades encefalopáticas con bases genéticas. Además con el presente trabajo queremos establecer un nuevo modo de trabajar con estas células mediante su criopreservación que nos permita tener disponibilidad de las células en el momento que nos sea necesario.

Por lo que nuestras hipótesis de partida en la presente Tesis, basándonos en los trabajos previos realizados por el grupo y otros laboratorios son:

A) Los precursores GABAérgicos trasplantados en modelos de EEIs serán capaces de revertir total o parcialmente el fenotipo mutante causados por las mutaciones presentes en los modelos

B) La Criopreservación in toto de las células procedentes de la MGE no afectará negativamente a las características intrínsecas de los precursores GABAérgicos.

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Objetivos

46 Los objetivos principales de la presente Tesis son:

- Validar la eficacia de los precursores neuronales GABAérgicos procedentes

de la MGE como posible tratamiento de diferentes Encefalopatías Epilépticas Infantiles.

- Desarrollar sistemas de criopreservación estandarizados que nos permitan

disponer de una fuente de estos precursores para su posterior amplificación y uso en la clínica.

Para la consecución de estos objetivos, se establecieron las siguientes metas:

1) Analizar la capacidad de los precursores GABAérgicos derivados de la MGE para modificar la actividad neuronal y recuperar los perfiles normales de actividad electrofisiológica reduciendo el grado, frecuencia de las crisis y espasmos epilépticos en diferentes modelos animales de EEI.

a) Estudiar los efectos de las células aisladas de la MGE tras su implante en un modelo de Síndrome de West, enfermedad perteneciente a las encefalopatías epilépticas catastróficas infantiles.

b) Estudiar los efectos de las células de MGE trasplantadas en un modelo hipomórfico para Lhx6, como animal modelo de encefalopatía epiléptica.

1.1) Estudiar la distribución, supervivencia y diferenciación de las células derivadas del trasplante en un ambiente mutante epileptogénico.

1.2) Analizar el efecto de los trasplantes sobre las alteraciones del comportamiento que presentan estos modelos animales

2) Desarrollar protocolos estandarizados de criopreservación que nos permitan una alta viabilidad celular y preservar las propiedades intrínsecas de los precursores neuronales derivadas de la MGE.

2.1 Realizar ensayos in vitro de viabilidad, rendimiento y proliferación celular.

2.2 Analizar los precursores GABAérgicos criopreservados in vivo mediante su trasplante intracerebral para verificar el mantenimiento de sus propiedades intrínsecas.

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Material y Métodos

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1 Animales de Experimentación

Los animales de experimentación usados en esta Tesis Doctoral han sido varias líneas congénitas y transgénicas de Mus musculus (Muridae, Rodentia, Mammalia). Los ensayos se realizaron en tres laboratorios distintos, siendo el principal el Laboratorio de Terapia Celular para Neuropatologías del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa, en adelante CABIMER. Los otros dos laboratorios, en los que se realizaron sendas estancias de formación, fueron The Children’s Hospital of Philadelphia, en adelante CHOP, y National Institute for Medical Research, Londres Las cepas utilizadas son las que ha continuación nombramos:

CD1

C57/Black6 129sv Hembras

GFP+ en fondo CDA1 o C57/Black6 Dlx5/6-cre-Ires-GFP+

GAD67-GFP+

ARXGCG7 en fondo C57/Bl6: Lhx6 LacZ en fondo C57/Bl6 Lhx6 – en fondo C57/Bl6