El control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y más efectivas de influenciar la separación de los componentes. La columna se fija entre un inyector mantenido a una temperatura de inyección, y un detector mantenido a una temperatura también predeterminada. Por lo tanto, se debe definir la temperatura a la que cada uno de los componentes opera.
En general, caben dos posibilidades de modificación de las condiciones de trabajo cromatográficas. En cromatografía gaseosa, la temperatura debe ser mantenida por encima del “punto de rocío” de la muestra, pero no por encima de su punto de ebullición.
(a) Modalidad Isocrática, en la que las condiciones experimentales permanecen constantes durante el proceso cromatográfico.
(b) Modalidad no Isocrática, en la que durante el proceso de separación cromatográfica se varia de manera gradual y estrictamente controlada el parámetro de temperatura. La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a él.
Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución, pero conforme la temperatura es mayor la elución es más rápida, pero corriendo el riesgo de descomponer el analito. Por ejemplo:
Si al meter a eluir una muestra nos salen cuatro analitos con tiempos muy diferentes de elución la temperatura adecuada para que eluyan todos se calcula con la rampa de temperatura:
Procesamiento de datos cromatográficos
Capítulo 8 111
Se toman los primeros 5 minutos como 60 °C y a partir de estos 5 minutos cada minuto adicional se le aumenta 10°C, por ello observamos en el primer pico 80°C, ya que los primeros 5 minutos se toman como 60° más 2 minutos se le suman 10°C esto es precisamente 80°C y así, se trabaja con los siguientes picos, tomando en cuenta la escala de temperatura.
Esto es muy importante ya que si en nuestra muestra solo se vieran dos picos uno en 11 minutos y otro en 20 la temperatura e elución correcta seria una que estuviera entre estos dos puntos, con lo que se correría muy bien la muestra y no tendríamos que esperar mucho entre a y otra.
HPLC (Cambios en la fase móvil.)
El proceso de elución en cromatografía de adsorción, el disolvente compite con las moléculas de soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto del adsorbente es independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
La fuerza eluyente (ε0 ) es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor de cero para el sistema pentano/ sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
Capítulo 8 112 respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente , tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna.
La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza por que la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente.
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una
elución en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de aumento
de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del disolvente.
En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo así un gradiente continuo el análisis utilizando el método de elución por gradiente permite mantener una resolución deseada y al mismo tiempo disminuir la duración del análisis.
Por ejemplo en la figura 15 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente de la elución isocrática de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separación con fase inversa , la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace más polar . El primer cromatograma (superior izquierda) se obtuvo con un disolvente que tenía 90% de acetonitrilo y 10% de tampón acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rápidamente. Se observan sólo 4 picos por que los demás están solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgánico. El primer cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con 80% de B, se consigue una separación un poco mejor, observándose 5 picos. Con 60% de B, se empiezan a ver 6 picos. Con 40% de B se ven claramente 8 picos. Con 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separación tarda demasiado (cerca de 2 horas).
A partir de los datos obtenidos con las elusiones isocráticas de figura 13, se eligió el gradiente que se presenta en la figura 25.11, con el que se consiguió resolver todos los picos en 38min. Primero se trabajo con 30% de B (B=acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1,2,3. A continuación se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente se modifico el disolvente hasta alcanzar un 80% de B en 2 minutos, manteniéndose esa composición para eluir los últimos picos.
Procesamiento de datos cromatográficos
Capítulo 8 113
Figura 15. Separación isocrática en HPLC de una mezcla de compuestos aromáticos en una columna Hypersil ODS (C18 sobre sílice de 5μm), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( ˜22°C). (1) alcohol bencílico, (2) fenol, (3)3¨,4¨-dimetoxiacetofenona, (4) benzoína, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) o- metixibifenilo.El eluyente estaba formado por un tampón acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El tampón contenía KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografía es utilizada para análisis del principio activo de un producto farmacéutico, por ejemplo la determinación de cafeína y ácido acetilsalicílico en cafiaspirina, los siguientes datos fueron obtenidos para determinar la cantidad de cafeína y ácido acetilsalicílico contenidos una tableta de cafiaspirina. En este caso se realizo el análisis en HPLC
Para tal análisis se tomo como estándar las siguientes concentraciones de cafeína y ácido acetilsalicílico:
Ccafeína = 0.03mg/mL CAAS = 0.53mg/mL
Se realizo el análisis y se obtuvieron los siguientes resultados.
Capítulo 8 114
Cromatograma de la inyección número 4 del estándar Cromatograma de la inyección número 5 del estándar
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente ecuación A=FrC.
Fr cafeína = 177018.4 / 0.03 = 5900613.33
Fr AAS = 751481.4 / 0.53 = 1417889.43 Análisis de la tableta de CAFIASPIRINA
Posteriormente se analizo la tableta de Cafiaspirina
(lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
Cafeína Ácido Acetilsalicílico
Núm. Inyección Área Núm. Inyección Área
1 149019 1 615352 2 187639 2 784811 3 162884 3 684670 4 201409 4 874595 5 184141 5 797979 Ã=177018.4 Ã=751481.4
Procesamiento de datos cromatográficos
Capítulo 8 115
Cromatograma de la inyección #1 de la muestra problema Cromatograma de la inyección #2 de la muestra problema
Cromatograma de la inyección # 3 de la muestra problema
Cafeína Ácido Acetilsalicílico
Núm. Inyección Área Núm. Inyección Área
1 177343 1 678496
2 178856 2 717425
3 182458 3 723643
Ã= 179552.3 Ã= 706521.3
Con los datos de las áreas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de cafeína y ácido acetilsalicílico en cada tableta.
Capítulo 8 116 C cafeína = 179552.3 / 5900613.33 = 0.0304
0.0304 * 10/ 1 * 100 = 30.4 mg
Cada tableta de cafiaspirina contiene 30.4 mg de cafeína
CAAS = 706521.3 / 1417889.43 = 0.4983
0.4983 * 10 / 1 * 100 = 498.3 mg
Cada tableta de cafiaspirina contiene 498.3 mg de ácido acetilsalicílico
Determinación del grado alcohólico de una bebida
Conocer el contenido de etanol en muestras analizadas a partir del método del estándar interno. Se analiza el tequila comercial “Herradura”, EtOH 40%
Se trabajo a 70°C y se realizaron corridas a diferentes concentraciones de EtOH (2, 4, 6, 8, 10%v/v) y una concentración constante de Acetona (6%v/v; estándar interno. Para la curva patrón, las diferentes disoluciones se realizaron a partir de una solución Stock de EtOH al 20%.
En los cromatogramas aparecen 2 picos con 2 áreas diferentes. El primer pico y área corresponde a la acetona, ya que es el compuesto menos polar. El segundo correspondo al del EtOH. Los valores de área para la curva patrón:
Área [Acet] [Acetona](%) Área [EtOH] [EtOH](%)
752578 6 225296 2 394769 6 125961 2 175540 6 57133 2 Promedio 440962.3333 136130 270166 6 198196 4 251991 6 183560 4 168917 6 142527 4 Promedio 230358 174761 183014 6 207592 6 177426 6 219475 6