VIH1
Los estudios bioquímicos in vitro del reconocimiento molecular relacionados con el ensamblaje de la cápsida de VIH‐1, y su inhibición por diferentes compuestos, se habían realizado hasta ahora en soluciones diluidas, con un bajo contenido total de
INTRODUCCIÓN
muy elevadas (de 50 a 400 mg/ml). Este tipo de medios no se denominan “concentrados”, puesto que no hay una sola especie macromolecular a alta concentración, sino que todas las especies juntas ocupan una fracción significativa del volumen. Por ello, este tipo de medios se conocen como “aglomerados” (crowded) si las especies macromoleculares están en solución, o “confinados” (confined) si los compuestos están estructurados (como en el citoesqueleto) (Minton, 1983; 1993; 1998; 2001; Zhou, et al., 2008).
En un medio diluido, los solutos ocupan un volumen despreciable del total de la solución. Por el contrario, en un medio aglomerado (como son los fluidos fisiológicos) los solutos ocupan una fracción importante (volumen excluido) del volumen total de la solución. En general las condiciones de aglomeración macromolecular (macromolecular
crowding) producirán un aumento de la actividad química de las especies en solución,
puesto que al disminuir el volumen disponible de la solución, aumenta la “concentración efectiva” de los solutos. El incremento de actividad química para cada macrosoluto del sistema dependerá de una serie de factores, como su tamaño relativo, forma y concentración. Por ello, las características de las reacciones químicas en que estos solutos estén implicados como reactivos o productos se verán modificadas de maneras diversas en medios aglomerados, con respecto a medios diluidos.
Más en concreto, la teoría predice que la aglomeración macromolecular puede modificar considerablemente la velocidad y equilibrio de cualquier reacción macromolecular en la que haya una diferencia significativa entre el volumen excluido por los reactivos y el volumen excluido por los productos. En general las reacciones de asociación pueden estar controladas por la difusión o por el estado de transición, pudiéndose expresar la constante cinética de asociación entre dos moléculas kA como
(Zhou, et al., 2008): (Ecuación 1) 28
siendo kD la constante cinética de asociación bajo control de la difusión y kreact la
constante cinética de asociación bajo control del estado de transición. La aglomeración molecular afectará a estas dos constantes en distinto sentido. La kD es proporcional a la
constante de difusión de los reactivos, y en un entorno aglomerado la difusión se ve más impedida. Por otra parte la kreact viene dictada por la barrera energética que surge por los
cambios conformacionales necesarios para la formación del estado de transición del complejo. Como el estado de transición de una reacción de asociación en solución es, generalmente, casi tan compacto como el producto, la aglomeración molecular tiende a disminuir la barrera energética y, por lo tanto, a incrementar la constante de asociación. Cuál de ambas influencias de la aglomeración molecular sea más importante dependerá de si la reacción está gobernada en mayor medida por la difusión o por el estado de transición. Típicamente las asociaciones rápidas están bajo control de la difusión, y la
INTRODUCCIÓN
aglomeración molecular tiende a decelerarlas; mientras que las asociaciones lentas están bajo control del estado de transición, y la aglomeración molecular tiende a acelerarlas (Zhou, et al., 2008).
El interior celular, donde se ensambla la cápsida inmadura de VIH‐1, y también el interior del virión de VIH‐1, donde se ensambla la cápsida madura, constituyen medios aglomerados, donde la concentración total de macromoléculas es extremadamente elevada. Por tanto, puede ser muy importante tener en cuenta el efecto de la aglomeración macromolecular en las características de las reacciones que tienen lugar en estos compartimentos, como lo son el ensamblaje de la cápsida madura, o la capacidad inhibitoria de péptidos y otros compuestos sobre la reacción de ensamblaje.
Una de las predicciones de la teoría de aglomeración macromolecular es que procesos de polimerización (como el ensamblaje de una cápsida vírica) que estén poco favorecidos en condiciones diluidas pueden verse significativamente favorecidos en condiciones fisiológicas de aglomeración macromolecular. Hasta el momento, en nuestro conocimiento sólo existía un estudio de los efectos de aglomeración macromolecular en la morfogénesis de VIH‐1 (o de cualquier otro virus), que fue realizado en nuestro laboratorio. El ensamblaje de partículas con la organización de cápsidas maduras de VIH‐ 1, a partir de moléculas de CA en solución, sólo había sido posible in vitro utilizando concentraciones molares de sal para conseguir una elevadísima fuerza iónica, absolutamente no fisiológica (Lanman, et al., 2002). El estudio realizado en nuestro laboratorio demostró que la adición de un agente aglomerante a baja concentración de sal, para simular condiciones cercanas a las fisiológicas en la actividad química de CA y en la fuerza iónica, fue suficiente para permitir in vitro el ensamblaje eficiente de partículas con la organización estructural de la cápsida madura de VIH‐1 (del Alamo y Mateu, 2005). Sin embargo, en este estudio experimental inicial no se analizó el efecto de la aglomeración molecular sobre cada una de las diferentes interfases CA‐CA que intervienen en el ensamblaje de la cápsida madura.
FIGURA 11. Efecto de la aglomeración macromolecular en el volumen disponible para una molécula en función de su tamaño. Se ilustra
el volumen excluido (rosa + negro) y el volumen disponible (azul) en una solución de moléculas esféricas. (a) Volumen disponible para una pequeña molécula de tamaño comparable al solvente. (b) Volumen disponible para una macromolécula de tamaño comparable al de las moléculas del fondo. Imagen reproducida de (Minton, 2001).
INTRODUCCIÓN
macromolécula que para una molécula de tamaño pequeño (Fig. 11), la actividad inhibidora de pequeñas moléculas sobre procesos de asociación macromolecular podría verse considerablemente reducida (Minton, 1993). Sin embargo, esencialmente no existían evidencias experimentales para demostrar esta predicción, y en ningún caso se había explorado su validez en un sistema de inhibición de un proceso de multimerización, como es l ensamblaje de una cápsida vírica. 30 e
OBJETIVOS
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Nuestro grupo está interesado en el estudio de relaciones estructura‐función en el ensamblaje, estabilidad y dinámica conformacional de cápsidas víricas. Este tipo de estudios ayudan a entender aspectos básicos de etapas poco conocidas del ciclo vírico, y además suministran una base para el diseño racional de vacunas y antivirales. En nuestro laboratorio se están actualmente utilizando tres virus modelo muy diferentes, el virus de la fiebre aftosa, el virus diminuto del ratón y VIH‐1, en función del aspecto concreto que deseamos analizar.
Apoyándose en resultados obtenidos previamente por diferentes grupos, incluido el nuestro, el objetivo general de esta Tesis ha sido el profundizar en diferentes aspectos relacionados con el ensamblaje de la cápsida de VIH‐1 y el diseño racional y análisis de compuestos capaces de inhibir este proceso. Los objetivos concretos han sido los siguientes: 1. Estudiar si condiciones de aglomeración molecular, como las que se dan en un entorno fisiológico, y/o la presencia del dominio CTD pueden favorecer la capacidad del dominio NTD para formar hexámeros, un proceso crítico para el ensamblaje de la cápsida madura de VIH‐1.
2. Estudiar si las condiciones de aglomeración molecular pueden reducir la capacidad inhibitoria de pequeñas moléculas sobre el ensamblaje de una cápsida vírica, y en particular sobre la formación de la cápsida madura de VIH‐1.
3. Diseñar y modificar racionalmente péptidos que actúen como inhibidores interfásicos del ensamblaje de una cápsida vírica, y en particular de la cápsida madura de VIH‐1, y analizar su capacidad de interferir con el ensamblaje de la cápsida in vitro y la infectividad del virión ex vivo.
4. Explorar soluciones combinatoriales para el reconocimiento entre subunidades en una cápsida vírica, en particular en la interfase CTD‐CTD implicada en el ensamblaje de la cápsida de VIH‐1; la información obtenida se orientaría a la modificación racional de inhibidores interfásicos (objetivo 3), para aumentar su capacidad inhibitoria o mejorar alguna de sus otras características.
5. Realizar una caracterización termodinámica y cinética y un análisis mutacional de una interfase alternativa de dimerización CTD‐CTD producida mediante intercambio de dominios, y analizar el papel del MHR en la formación de esta interfase.