Capítulo 4. Discusión
4.1 CSE-7 y su relevancia en el tráfico vesicular de la CHS-4
Hasta la fecha se desconocía el mecanismo por el cual la CHS-4 es transportada en N. crassa desde sus sitios de síntesis hasta los sitios de síntesis activa de pared celular, mientras que la ruta de síntesis y tráfico de Chs3p, su ortólogo en S. cerevisiae, ha sido muy bien caracterizada.
Los quitosomas son los acarreadores subcelulares especializados que transportan a las CHSs en forma de zimógeno a la MP (Bartnicki-García et al., 1978; Bartnicki-Garcia, 1990). Este estudio brinda información sobre la biogénesis de los quitosomas acarreadores de la CHS-4 (Clase IV), una de las 7 quitinas sintasas (CHSs) del hongo filamentoso N. crassa, y de su tráfico hacia las zonas de crecimiento activo de la pared celular.
Hace cuatro décadas se especuló sobre el origen posible de los quitosomas. Una de las teorías sugería que los quitosomas provenían del RE debido a su grosor y apariencia (Bracker et al., 1976). En el presente estudio se demostró que la llegada de la CHS-4 al núcleo del Spk y septo en formación depende de la proteína transmembranal CSE-7, supuestamente una proteína accesoria de RE. Se analizó el efecto de BFA a diferentes concentraciones (5, 10, 25, 50, 100 y 200 µg mL-1) sobre la distribución de CHS-4, en
donde se observó que a altas concentraciones del inhibidor (200 µg mL-1) la llegada de la CHS-4 al Spk se
interrumpía, y confirmando el paso de la CHS-4 por la ruta de secreción clásica RE-Golgi. Esto contrasta con los reportes previos que mostraron que BFA no afectaba la localización de CHS-1, CHS-3 y CHS-6 en el núcleo del Spk y en los cuales se había sugerido que éstas CHSs no siguen la ruta secretora convencional RE-Golgi (Riquelme et al., 2007; Sánchez-León et al., 2011). Sin embargo, en esos estudios se usaron concentraciones de BFA más bajas (1.40 µg mL-1 y 5 µg mL-1)(Riquelme et al., 2007; Sánchez-
León et al., 2011) que las evaluadas en este trabajo. Por otro lado, en otro trabajo se evaluó la co- expresión de CHS-1-mChFP y GFP-YPT-1 bajo el efecto de BFA a concentraciones más altas (200 y 300 µg mL-1) y se observó que GFP-YPT-1 se acumulaba en pequeños “clusters”, los cuerpos de brefeldina, y se
interrumpía su llegada al Spk, mientras que la CHS-1-mChFP seguía llegando al núcleo del Spk (Sánchez- León et al., 2015). Todo lo anterior indica que al menos el tráfico de CHS-4 ocurre a través del RE. Se ha descrito que las chaperonas moleculares de RE son proteínas que ayudan y controlan el plegamiento de proteínas, cuyo destino es el espacio extracelular o compartimentos subcelulares particulares (Hendrick y Hartl, 1993). Se ha demostrado en trabajos previos que las chaperonas residentes de RE, tales como Shr3p, Gsf2p, Pho86p y Chs7p, con múltiples dominios transmembranales actúan como proteínas especializadas, usando sus dominios transmembranales para regular la inserción apropiada así como el plegamiento correcto de proteínas membranales politópicas dentro de la
membrana del RE (Kota y Ljungdahl, 2005). Estas proteínas chaperonas son específicas para sus sustratos afines y la ausencia de éstas conduce a la acumulación de su proteína blanco en el RE (Ljungdahl et al., 1992; Sherwood y Carlson, 1999; Trilla et al., 1999; Lau et al., 2000). En S. cerevisiae Chs7p tiene una importante participación como una proteína especializada residente de RE que facilita el adecuado plegamiento de la Chs3p antes de su salida del RE (Kota y Ljungdahl, 2005) y también regula la actividad de la quitina sintasa III (CSIII) (Trilla et al., 1999). En C. albicans tiene un papel similar (Sanz et al., 2005). En N. crassa se encontró que la participación de CSE-7 tiene un papel muy importante en la llegada de la CHS-4 al núcleo del Spk y septo. Sin embargo, mutantes nulas Δcse-7 no mostraron un fenotipo afectado, ni disminución de la tasa de crecimiento. En S. cerevisiae la mutante nula de ΔCHS7 exhibe alrededor del 13% del contenido de quitina en comparación con la del tipo silvestre, así como una marcada disminución en la actividad de quitina sintasa CSIII (Trilla et al., 1999). En C. albicans la mutante nula
CHS7Δ presenta niveles de quitina reducidos así como menor actividad quitina sintasa; las células además muestran alteraciones morfogenéticas así como virulencia atenuada (Sanz et al., 2005). En micelio de N. crassa la chs-4 tiene niveles de expresión altos, pero la mutante Δchs-4 no mostró diferencias en la tasa de crecimiento en comparación con la del tipo silvestre ni un fenotipo aberrante a pesar de los altos niveles del transcrito de chs-4 en micelio de N. crassa (Herold y Yarden, 2016). Lo anterior apoya la idea de que otras CHS pueden estar compensando la ausencia de la CHS-4 y además podría explicar el porqué la tasa de crecimiento y el fenotipo de la mutante de Δcse-7 en N. crassa
tampoco se muestra significativamente afectada. Por otra parte, dado que las mutantes Δchs-1, Δchs-3,
Δchs-7 y Δchs-6, así como la mutante doble Δchs-1;Δchs-3 (Fajardo-Somera et al., 2015) presentan una considerable disminución en la tasa de crecimiento y fenotipo afectado, la carencia de un fenotipo mutante en la cepa Δcse-7,sugiere que la CSE-7 no participa en la ruta secretora del resto de las CHSs. Quizás esas CHS dependen de la otra proteína hipotética identificada como segundo ortólogo de Chs7p.
4.2
Caracterización de la distribución de CSE-7 en hifas de N. crassa
CSE-7 fue etiquetada con GFP y el análisis mediante microscopía mostró que ésta se localiza principalmente en lo que denominamos como una red de cisternas alargadas (NEC por sus siglas en inglés, Network of Elongated Cisternae) localizada en el citoplasma de las hifas de N. crassa. En un principio se planteó que la NEC pudiera corresponder a la estructura del RE en N. crassa, tomando en cuenta el antecedente previo de que CSE-7 es el ortólogo a Chs7p de S. cerevisiae, descrita como una proteína chaperona de RE. Sin embrago, la co-expresión con otros marcadores indicaron que la NEC comprende compartimentos que habían sido previamente descritos como vacuolas tubulares. En otros eucariotas bien estudiados, el RE ha sido bien descrito como una red compleja de túbulos
endomembranosos interconectados así como cisternas que ocupan completamente el citoplasma (Viotti, 2014).
En estudios previos en N. crassa, marcadores del RE incluyendo BEM-46 (miembro de las α/β-hidrolasas), NCA-1 (a SERCA-tipo Ca2+-ATPasa) y dos proteínas RE predichas (DPM y GRP-78) han sido identificados
exclusivamente en la envoltura nuclear RE (Bowman et al., 2009; Mercker et al., 2009). Aquí, imágenes de SDLCM muestran que NCA-1 además de estar en el RE perinuclear también se localiza en algunas regiones del NEC dilucidadas por CSE-7. Esto indica que: primero ambas proteínas localizan principalmente en diferentes compartimentos, pero que en algún punto de la vía de secreción coinciden en la NEC y en segundo que el RE está más interconectado de lo que los datos microscópicos actualmente sugieren. Estudios recientes en N. crassa describieron la distribución subcelular de p24 proteínas cargo adaptadoras de RE como ERV-25, EMP-24, ERP-1 and ERP-3, las cuales co-localizan en la envoltura nuclear en conidios (Starr et al., 2017). En hifas maduras EMP-24, ERV-25 and ERP-3 co- localizan con el marcador de RE NCA-1, y en el caso de EMP-24 también se observó una co-localización con Golgi temprano. ERP-1 parece co-localizar con estructuras tubulares que los autores argumentan podrían ser vacuolas tubulares (Starr et al., 2017) y que podrían corresponder a las mismas estructuras que las reveladas por CSE-7. Se identificó otro marcador para visualizar el RE, SEC-63-GFP la cual localiza en estructuras tubulares interconectadas en regiones muy cercanas a los núcleos. Los compartimentos mostrados por SEC-63 fueron mayoritariamente diferentes de las estructuras de CSE-7. La co-localización parcial entre NCA-1 y SEC-63 sugiere que los dos marcadores están localizados en diferentes regiones del RE.
En S. cerevisiae Sec63p se encuentra distribuida alrededor del núcleo (Feldheim et al., 1992), pero también en una red de túbulos interconectados denominada como RE periférico (=cortical) (Prinz et al., 2000). En Aspergillus nidulans Sec63 se describió que se encontraba como hebras periféticas así como en la envoltura nuclear, formando parte del RE (Markina-Iñarrairaegui et al., 2013). Adicionalmente se usó un tercer marcador de RE, mChFP-HVEL, el cual mostró una co-localización parcial con CSE-7-GFP, pero que estuvo ausente en el núcleo del Spk y en el septo, sugiriendo que la red tubular revelada por estas proteínas podría ser parte del RE. La co-expresión de H1-RFP y CSE-7-GFP mostró que CSE-7-GFP no está rodeando los núcleos, pero sí localiza en regiones cercanas a ellos, lo que sugiere que la NEC revelada por CSE-7-GFP corresponde a un compartimento diferente que el de la envoltura nuclear.
Tomando en cuenta los hallazgos obtenidos de la co-expresión de CSE-7-GFP con los diferentes marcadores de RE se sugiere que la estructuración y distribución del RE puede ser compleja y que la localización parcial de algunas proteínas marcadoras de RE sólo refleja una parte de esta complejidad. La distribución del RE ha sido previamente descrita en otros hongos filamentosos. En A. oryzae el RE fue
descrito como una red interconectada a lo largo de la hifa, y como una red tubular localizada en el septo (Maruyama et al., 2006). En Ustilago maydis el RE fue encontrado como una red cortical, periférica y en la envoltura nuclear (Wedlich-Söldner et al., 2002). La diferencia en la estructura del RE descrita para estas especies de hongos podría deberse a las diferencias en la tasa de crecimiento y el tamaño de las hifas que ellas presentan. Se interpretó que las estructuras reveladas por CSE-7 que se encuentran cercanas a la superficie de la célula observadas mediante microscopía TIRFM podrían corresponder al RE cortical.
BFA es un inhibidor usado tradicionalmente para estudiar la ruta secretora convencional ER-Golgi. En este trabajo se observó que la llegada de CSE-7 al núcleo del Spk se interrumpe bajo el efecto del inhibidor, también se observaron cambios en la organización estructural de la NEC, esto concuerda con estudios previos en el basidiomiceto Pisolithus tinctorius donde BFA afecta la distribución y morfología del sistema de endomembranas (Cole et al., 2000).
Dado todo lo anterior, consideramos que NEC es una colección de RE y vacuolas tubulares que recorren el citoplasma de las hifas en las regiones II y III y que tienen un papel principal en la biogénesis y secreción de proteínas (Figura 37).
Además de su localización en NEC, CSE-7-GFP también se encontró como partículas discretas en regiones subapicales, en septos y en el núcleo del Spk, como lo observado para CHS-4. Usualmente las chaperonas de RE son proteínas residentes que si llegasen a escapar del RE, regresan a éste debido a secuencias en la misma proteína que actúan como señales de recuperación (Pfeffer y Rothman, 1987; Pelham, 1988; Lewis et al., 1990; Nilsson y Warren, 1994). Proteínas residentes en el lumen del RE tienen en su región carboxilo terminal una señal de retención de RE que consiste en cuatro aminoácidos H/KVEL (Pelham, 1988; Pelham, 1990; Young et al., 2013). Poteínas transmembranales de RE tipo I (que poseen el amino terminal en el lumen del RE) tienen dos lisinas posicionadas en el tercero, cuarto y quinto residuo (K(X)KXX donde X es cualquier aminoácido) con respecto al carboxilo terminal, ésta señal funciona como una señal de retención. En proteínas transmembranales de RE tipo II (amino terminal en el citosol) tienen una señal que consiste de dos argininas (RR) dentro de los primeros cinco residuos del amino terminal (Jackson et al., 1990; Schutze et al., 1994). CSE-7 es una proteína transmembranal politópica. Se ha sugerido que en este tipo de proteínas los propios dominios transmembranales podrían mediar su retención en el RE (Smith y Blobel, 1993; Nilsson y Warren, 1994).
Dado que se observó una distribución similar de CSE-7-GFP expresada bajo el control de su correspondiente promotor endógeno Pcse-7, descartamos la posibilidad de que la localización subcelular de CSE-7-GFP en el núcleo del Spk fuera un artefacto de sobreexpresión resultante del uso del promotor Pccg-1. Una explicación posible para la localización de CSE-7 en un lugar diferente al RE, podría ser que
estuviera actuando como una chaperona escolta (“chaperone scort”) en lugar de chaperona residente de RE, o que viaja al Spk para realizar una función específica no descubierta aún en el ápice de las hifas. Un trabajo recientemente publicado demostró que Chs7p sale del RE y localiza en el cuello de la gema junto con la Chs3p, lo que sugiere que Chs7p no sólo actúa como una proteína chaperona sino que tiene un papel en la regulación de la actividad de Chs3p en la superficie celular (Dharwada et al., 2018). Estos resultados contradicen lo que por décadas se aceptó; que en S. cerevisiae la Chs7p estaba confinada a la periferia nuclear (RE perinuclear) y excluída de los sitios polarizados (Trilla et al., 1999).
CSE-7-mChFP restaura la localización de la CHS-4-GFP cuando es expresada en la cepa knock out Pchs4::chs-4-gfp::nat+;Δcse-7::hph+;his-3-;Δmus-51::bar+. En la cepa complementada la co-localización de
CHS-4 y CSE-7-mChFP ocurre sólo en regiones pequeñas de la NEC. Esta pequeña co-localización podría ser explicada por el hecho de que una vez que CSE-7-mChFP complementa la mutación, CHS-4-GFP no continúa acumulándose en la red tubular, por lo tanto, no es posible observar una co-localización clara de CHS-4 en la NEC dado que ahora CHS-4 está siendo activamente transportada a el núcleo del Spk y septo.
Como se mencionó anteriormente, lo que queda por investigar es si CSE-7 es realmente una proteína chaperona especializada, cuya función es ayudar en el apropiado plegamiento apropiado de CHS-4, como se describió en su ortologó Chs7p en S. cerevisiae. En experimentos previos de Co-IP seguido de análisis por LC/MS/MS, se identificaron 21 proteínas como posibles proteínas interactoras involucradas en el tráfico y regulación de CHS-4 (Fajardo-Somera et al., 2015). Entre estas proteínas interactoras, no se identificaron secuencias correspondientes a CSE-7 o de otras CHSs, a pesar de que estas proteínas están presentes en el núcleo del Spk y septo.