Cuantificación de factores en procesos angiogénicos

Las estimaciones para este tipo de evaluación son muy variadas, pero el patrón de valoración más utilizado en investigaciones similares a la presente es la siguiente:

- 0= Negativo (-), menos del 5% células teñidas

- 1= Poco positivo (+), 5% al 10% de las células teñidas

- 2= Moderadamente positivo (++), 10% al 50% de las células teñidas - 3= Fuertemente positivo (+++), más del 50% de las células se tiñen.

Estos métodos de medición reproducibles han sido utilizados en numerosos trabajos de investigación para la valoración de factores de la actividad angiogénica. En varias publicaciones se ha medido la expresión del VEGF a través de los niveles de mRNA o la proteína, mostrando el aumento de la expresión de VEGF en el tejido tumoral, apoyados en la IHQ y comparándose con su expresión en el tejido renal normal [58,59].

Nuestro grupo de investigación evaluó la expresión inmunohistoquímica de ubiquitin (Ub) en RCC, teniendo en cuenta la intensidad de la tinción y sus patrones de distribución. La intensidad de la tinción se obtuvo utilizando los siguientes criterios: 0, sin tinción detectable; 1, baja intensidad; 2, moderada intensidad; y 3, de tinción fuerte. La extensión de la tinción se puntuó como 0, sin tinción detectable; 1, tinción baja y difusa (células teñidas < del 10%); 2, moderada (entre 10% al 50% de células teñidas), y 3, la tinción homogénea fuerte (>del 50% de células teñidas). La puntuación final se determinó como el producto de la intensidad y la extensión (0-9) [126].

Los protocolos de valoración utilizados en este área son similares y buscan en general la estimación de los niveles de intensidad del marcaje (niveles de positividad + ó 1, ++ ó 2, +++ ó 3). Además de los niveles de carencia de intensidad de la reacción (negatividad ó 0). Lidgren y su equipo estudiaron la expresión de HIF-1 alfa en cuatro grupos según la intensidad de la tinción (0-3), donde los tumores que carecían de tinción se definieron como el grupo 0. Los grupos del 1 al 3 se definieron como HIF- 1 alfa positivo, pero se separaron en función de la intensidad (1=débil, 2=medio, 3=fuerte) [60]. Sümer y colaboradores estudiaron la expresión de VEGF y TSP-1 teniendo en cuenta el porcentaje de células tumorales positivas VEGF y el porcentaje de inmunorreactividad extracelular para TSP-1; se calificó como: 0 = sin tinción, 1= 0-25%, 2= 26-50%, 3= 51-75% y 4= 76-100%. La puntuación de la expresión fue calculada multiplicando el porcentaje de calificación positiva por el nivel de intensidad (escala de puntuación 0-12). Se estimó positiva para la TSP-1 sólo la inmunoreactividad extracelular, debido a que la reactividad citoplasmática y nuclear, se consideró inespecífica [120].

Yagasaki cuantificó la intensidad de la tinción de VEGF, TGF-β1 y MMP-2, clasificándola en una escala de cuatro grados: 0, ausencia de inmunotinción o tinción débil membranosa de las células tumorales; 1+, tinción membranosa en la mayoría de las células tumorales; 2+, difusa membranosa y / o tinción citoplásmica en grupos de células tumorales; y 3+, tinción citoplásmica significativa en la mayoría de las células tumorales [121].

Es poco común el uso de valoraciones más individuales y menos reproducibles. Los estudios de Xhang y su equipo valoraron la expresión de VEGF y MMP mediante la medición de la proporción de las células tumorales con tinción positiva de VEGF y MMP, en al menos en 10 campos diferentes. Las células tumorales fueron examinadas con un aumento de 100x para cada sección de tejido y una expresión se consideró positiva cuando el índice fue superior al 10% en cada caso [122].

La homologación de métodos de estimación cuantitativa en este campo se basa en su reproducibilidad y lógica científica. Actualmente, los adelantos tecnológicos (nuevas versiones de aplicaciones y software de medición) toman estas premisas como fundamento y pretenden mayor detalle en la diferencia de intensidades, sumado a la posibilidad de lectura simultanea de mayor cantidad de especímenes (TMA), sin perder la cualificación de la medición [119, 158]. El Image Pro- plus 7.0 y el Panoramic Viewer (fig. 1.14) utilizados por nuestro grupo de investigación son muestra de ello.

Figura 1.14 Panoramic Viewer A.- Visualización de TMA; B.- Identificación de componentes a medir; C.- Medición automatizada del TMA con Densito-Quant; D.- Visualización para valoración manual de TMA con Densito-Quant

1.6 Hipótesis y objetivos

1.6.1 Hipótesis

A la vista de los datos expuestos en la revisión bibliográfica se plantearon las siguientes hipótesis de trabajos:

1. El estudio morfométrico permite objetivar parámetros descriptivos para establecer patrones de comportamiento de la angiogénesis en el área tumoral del ccRCC, el área peritumoral y los riñones sanos. Además el estudio morfométrico nos permitirá comparar los resultados obtenidos en las diferentes zonas geográficas: Ucrania (zona radiocontaminada y zona no contaminada), España y Colombia.

2. Los patrones de comportamiento de la angiogénesis en el carcinoma renal de células claras (ccRCC) pueden variar de acuerdo a su procedencia geográfica y a la exposición a bajas dosis de radiaciones ionizantes de larga duración.

3. Habrá más vasos neoformados detectados por MVD en los ccRCC procedentes de zonas con mayor exposición a CPLDIR en comparación con los ccRCC de Ucrania provenientes de zona sin radiocontaminación, los ccRCC de Valencia España y los ccRCC de Colombia.

4. Los patrones de comportamiento de la angiogénesis en el riñón afecto por ccRCC, tanto en su zona tumoral como en la zona peritumoral estarán alterados en comparación a los evidenciados en el riñón normal.

5. La expresión de los factores angiogénicos y sus receptores tendrán un patrón de comportamiento diferente en el ccRCC según el nivel de exposición a la variable irradiación ionizante a bajas dosis por largos periodos.

1.6.2 Objetivos

Para contrastar estas hipótesis se propusieron los siguientes objetivos:

1- Estudiar los mecanismos de angiogénesis en el carcinoma renal de células claras (ccRCC), en el área peritumoral, y en el riñón sano a través de un estudio morfométrico de muestras procedentes de tres orígenes geográficos con condiciones ambientales especifica (diferente nivel de exposición a CPLDIR).

2- Analizar morfométricamente la densidad microvascular (MVD) en el ccRCC y el área peritumoral, previamente inmunomarcados con CD31, de tumores procedentes de Ucrania tanto de la zona radiocontaminada como de la zona sin radiocontaminación.

3- Analizar morfométricamente la MVD en el ccRCC, la zona peritumoral y el riñón sano, previamente inmunomarcados con CD31, de tumores procedentes de España y Colombia.

4- Analizar por morfometría la expresión de los diferentes factores participantes de la respuesta angiogénica (VEFG, HIF-α, FGF-β, VEFGR-1, VEFGR-2, VEFGR-3, PDGFR-β y la VE-cadherin) en el ccRCC y su área peritumoral procedentes de los tres diferentes orígenes geográficos y el riñón sano solo de España y Colombia, utilizando la inmunohistoquímica como apoyo a la morfometría.

2. METODOLOGÍA 2.1 Material