Cuantificación relativa

La cuantificación relativa proporciona un cálculo de los ratios de abundancia entre péptidos y proteínas por comparación de sus señales originadas a partir de diferentes muestras. Normalmente, es llevada a cabo en estrategias no dirigidas, permitiendo obtener el perfil cuantitativo de cientos de miles de péptidos pertenecientes a hasta más de diez mil proteínas [88].

3.1.1.1. Métodos de marcaje isotópico estable

La mayoría de los métodos de cuantificación relativa hacen uso de marcaje estable con isótopos pesados de 13_C, 15_N, 18_{O y} 2_{H. Estos isótopos pueden ser introducidos en las}

proteínas mediante incorporación de aminoácidos marcados en el medio de cultivo (SILAC [89]), mediante la utilización de reactivos químicos con idénticas propiedades fisicoquímicas (como iCAT [90] o iTRAQ [91]), o mediante marcaje enzimático (marcaje con 18_{O del extremo C-terminal de péptidos trípticos, [92]).}

Marcaje metabólico

El marcaje metabólico con isotopos estables introduce la marca durante el crecimiento y la división celular. Esto se consigue alimentando a los organismos con un

25 medio que contiene un subconjunto de metabolitos, tales como aminoácidos esenciales, marcados con isótopos pesados. El marcaje metabólico asegura menores desviaciones en la cuantificación de proteínas ya que las muestras en las diferentes condiciones son mezcladas en etapas iniciales del experimento, antes de la digestión tríptica. El marcaje simple con medio que contiene 15_{N ha sido llevado a cabo satisfactoriamente [93-97]}

consiguiendo una buena incorporación de los isótopos, pero las diferencias de masas dependen del número de átomos de 15_{N presentes en los diferentes péptidos por lo que}

presenta grandes dificultades el análisis de los datos y la cuantificación.

Un método computacionalmente mucho más simple fue desarrollado para solucionar este tipo de problemas. El marcaje SILAC [98] toma ventaja del hecho de que ciertos organismos son auxotróficos para ciertos aminoácidos. Estos aminoácidos pueden ser proporcionados en forma marcada o no marcada al medio de cultivo y ser incorporados por el organismo para la síntesis de sus proteínas in vivo. Los experimentos SILAC generalmente emplean lisina y arginina marcadas con diferente número de isótopos pesados 13_C, 15_{N y} 2_{H. Usando tripsina como proteasa de digestión se asegura que cada}

péptido resultante contendrá al menos un aminoácido marcado (excepto el péptido del extremo C-terminal de la proteína). La cuantificación se realiza por comparación de las intensidades de la envoltura isotópica de los péptidos marcados y no marcados de la misma secuencia. Este análisis ha sido apoyado por el desarrollo de herramientas informáticas como el software MaxQuant [99]. Esta técnica es aplicada no solo en cultivo, sino también a organismos completos como Drosophila [100] o ratones [101].

La consideración más importante a tener en cuenta usando SILAC es la conversión metabólica de los aminoácidos marcados isotópicamente en la célula. Esto puede llevar a dar a una cuantificación incorrecta si la ruta que lleva a la conversión de arginina a prolina es estimulada cuando la concentración de arginina no se ajusta correctamente [102].

Marcaje químico

Los métodos de cuantificación relativa por marcaje químico se basan en reacciones químicas (sin catálisis enzimática) entre un reactivo y los péptidos (o proteínas) en la muestra de interés. Los reactivos empleados pueden llevar una combinación diferente de isótopos estables lo que produce un desplazamiento de masa en el espectro MS (como en el marcaje dimetilo) o en el espectro MS/MS (como en el caso de los reactivos isobáricos como el iTRAQ).

Uno de las primeras técnicas de marcaje químico implementadas fue el ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags [103]). La marca química ICAT consta de tres partes, un reactivo específico de grupos sulfidrilos que reacciona específicamente con cisteínas, un grupo que permite el aislamiento por afinidad de las especies marcadas, biotina; y una región espaciadora en la que podemos encontrar la distribución isotópica natural (versión

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ligera) o una región espaciadora en la que encontramos 8 átomos de deuterio (versión pesada). El mayor inconveniente de esta aproximación es su limitación para marcar péptidos que carezcan de cisteínas y la posible aparición de reacciones secundarias.

Otro método de marcaje basado en el mismo principio es ICPL (Isotope-Coded

Protein Labels) [104]. Este tipo de marcaje da una ventaja significativa con respecto del

ICAT y es que reacciona específicamente con aminas libres, lo que permite que teóricamente todos los péptidos presentes en las muestras puedan ser marcados. En este sentido el marcaje con dimetilo, es una aproximación similar en la que usando dos reactivos simples [105, 106] como formaldehido y cianoborohidruro, se marcan aminas libres (N-terminal y residuos de lisina), permitiendo comparaciones dobles o triples. Esta aproximación es muy fiable y una alternativa barata de cualquier marcaje químico, ya que ofrece unos rendimientos cercanos al 100% con una reacción sencilla.

Un importante grupo de reactivos usados para la cuantificación relativa lo componen los marcajes químicos isobáricos. Estos se basan en el marcaje de los péptidos de diferentes muestras con reactivos con la misma masa molecular por lo que al marcar, los péptidos ganan el mismo incremento de masa. Al ser fragmentados generan diferentes iones reporteros en el espectro MS/MS cada uno de los cuales proviene de una muestra distinta. Uno de los más utilizados es el iTRAQ (isobaric Tags for Relative and Absolute

Quantification), comercializado por Applied Biosystems [107], un reactivo compuesto por

un grupo reactivo específico de aminas, un grupo balanceador y un grupo reportero. Las diferentes muestras son marcadas después de la digestión enzimática con reactivos que contienen una distribución diferente de isótopos pesados entre el grupo balanceador y grupo reportero, y posteriormente son mezclados. Los péptidos de cada muestra a comparar co-eluyen y son detectados en un único ion precursor. El marcaje iTRAQ está diseñado de tal manera que al fragmentarse los diferentes reactivos generan iones reporteros con la misma composición química, pero diferentes masas moleculares, debido a su composición isotópica diferente. Sus intensidades son proporcionales a las abundancias relativas de los péptidos marcados originarios de las diferentes muestras. Una de las mayores ventajas de este método es la capacidad de “multiplexado” en el que hasta 8 muestras pueden ser analizadas dentro de un único experimento. Una técnica basada en los mismos principios es el marcaje con TMT (Tandem Mass Tags) comercializado por Thermo Scientific [108], que permite la comparación de hasta 10 muestras con posibilidad de aplicarlo hasta 18 [109].

Una aproximación diferente para cuantificación a nivel de espectro MS/MS es el IPTL (Isobaric Peptide Termini Labeling) [110]. Este método utiliza marcaje isobárico secuencial en los extremos C- y N-terminal de los péptidos analizados con reactivos deuterados o no deuterados. La ventaja fundamental de esta técnica es que la cuantificación utiliza varios

27 puntos por espectro MS/MS, aunque esto hace que se complique enormemente el análisis de datos.

Una ventaja fundamental de todos los marcajes químicos es que pueden ser aplicados a prácticamente cualquier tipo de muestra (cultivo celular, tejido o fluidos corporales), en contraste con el marcaje metabólico.

Marcaje enzimático

El marcaje isotópico estable puede ser incorporado durante la digestión de las proteínas usando agua pesada (H218O) o ligera (H216O) en el proceso, incorporando,

respectivamente, dos átomos de 18_{O u} 16_{O en el C-terminal de los péptidos generados, lo}

que resulta en una variación de masa de 4 Da entre los péptidos ligero y pesado [111, 112]. Este marcaje puede también incorporarse en un paso posterior con una segunda incubación con la proteasa. Este método asegura un marcaje casi completo y carece de reacciones secundarias, pero, a pHs extremadamente ácidos se puede revertir la reacción [113]; sin embargo, las condiciones suaves provocadas durante la ionización ESI, por electroespray; o MALDI, ionización láser asistida por matriz (Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization), no influyen en la estabilidad del marcaje.