Cultivo de linfocitos

Los cultivos de linfocitos se realizaron según el protocolo establecido en nuestro laboratorio, añadiendo 0,5 mL de sangre total a 4,5 mL de medio completo constituido por RPMI 1640, 15 % de suero bovino fetal inactivado, 1 % de antibióticos (penicilina y estreptomicina) y 1 % de L-glutamina. Para la estimulación de los linfocitos se añadió un 1 % de fitohemaglutinina al medio de cultivo.

Se realizaron en paralelo 2 cultivos por individuo, que se incubaron en la oscuridad a 37 oC

en un incubador de CO2, por un período de 72 h.

3.1.3.2.1. Protocolo del ensayo de SCE

Para la detección de los SCE se añadieron 20 μL de BrdU, a la concentración de 8 μg/mL

(≅ 26,05 μM), al inicio de los cultivos. Las células cultivadas en presencia de BrdU

incorporan este análogo en lugar de la timina en el DNA sintetizado de nuevo y, después de 2 ciclos celulares, la diferencia en el contenido de BrdU entre cromátidas hermanas puede detectarse mediante una tinción específica. Para evitar los SCE inducidos por la fotólisis de la BrdU, los tubos de cultivo se envuelven en papel de aluminio y, posteriormente, se incuban durante 70 h. Trascurrido este tiempo, se añaden 0,05 mL de

Colcemid (0,1 μg/mL) para detener la división celular y obtener células en metafase, lo

que permitirá una mejor visualización de los cromosomas. Los cultivos se incuban 2 h más y, al completar las 72 h, se finaliza la fase de cultivo. La etapa siguiente consiste en la fijación de las células. En el primer paso se centrifugan las células a 1000 rpm (200xg), durante 8 min. Después, el sobrenadante se elimina por aspiración, el botón celular se resuspende en aproximadamente 5 mL de una solución acuosa de cloruro potásico (0,075 M) y se incuba en un baño térmico durante 20-25 min a 37 ºC. Pasado este tiempo, se realiza una nueva centrifugación, se aspira el sobrenadante y se realiza la fijación de los cultivos en una solución de Carnoy fría (metanol/ácido acético, 3:1 en volumen). Este procedimiento se repitió 3 veces, a fin de conseguir un sobrenadante limpio. La suspensión

celular obtenida se almacenó a 4 ºC durante un mínimo de 18 h para asegurar la fijación completa y, transcurrido este tiempo, los linfocitos fijados se centrifugan y resuspenden en una pequeña cantidad de Carnoy. Posteriormente, esta suspensión se gotea desde una cierta altura, en portaobjetos previamente limpios y desengrasados (mantenidos en alcohol a -20 ºC). Para cada individuo y réplica se han realizado un total de 3 preparaciones (6 portas/individuo), que se han secado al aire, a temperatura ambiente y protegido de la luz durante un período igual o superior a 3 días, antes de que se realizara el proceso de tinción. Para llevar a cabo la tinción, se ha utilizado una adaptación de la técnica de fluorescencia más Giemsa (FPG), propuesta por (Perry y Wolff, 1974). Al principio, las preparaciones se

sumergen en una cubeta con una solución (1,8 μg/mL) del colorante fluorescente Hoescht

33258 durante 20 min, en la oscuridad y a temperatura ambiente. Después se lavan con abundante agua corriente, se colocan horizontalmente en cubetas de vidrio, cubiertas con una solución de KCl (0,075 M) y se exponen a luz negra (a una distancia de 17 cm) durante 2 h. En este paso ocurre la fotodegradación del fluorocromo Hoescht y de la BrdU, de manera que el tiempo de exposición a la luz debe ser bastante exacto. Se lavan enseguida las preparaciones y se incuban en una solución salina 2x SSC a 45 ºC. Después de 15 min, se lavan de nuevo y se dejan secar al aire. Cuando están secas, se tiñen con una solución de Giemsa/tampón fosfato (1:9) durante 10 min. Finalmente, se lavan por última vez y se dejan secar al aire. A continuación, las preparaciones se montan utilizando 3 gotas de Entellan y cubreobjetos. Pasadas 3 h, ya se pueden observar al microscopio.

El análisis de los SCE (2 réplicas por cada individuo) se hizo utilizando un microscopio óptico (Leitz Aristoplan) con un aumento de 1.000 x. Se estudiaron 100 metafases (50 por cada réplica) para determinar la frecuencia de metafases de 1ª, 2ª y 3ª generación (MI, MII y MIII, respectivamente); para ello, las células se distinguen según las diferencias en la coloración de las cromátidas hermanas (ver fig. 6).

Metafase de 1ª división

Metafase de 2ª división, con SCE

Metafase de 3ª división

A partir de estos datos se ha calculado el índice de proliferación celular (PRI), que es un parámetro empleado como criterio de citotoxicidad. Para el cálculo del PRI se ha utilizado la siguiente fórmula (Lamberti et al., 1983):

PRI = (MI + 2 MII + 3 MIII) / No total de metafases

Para determinar la frecuencia de SCE, se estudiaron un total de 50 metafases de 2ª división/individuo. Se buscó que las metafases poseyeran calidad suficiente y un número

de cromosomas 2n = 46 ± 1. Además, se calculó la proporción de células que presentaban

una alta frecuencia de SCE (High frequency cells- HFC). Para ello, se han considerado

como HFCs aquellas células cuya frecuencia de SCE es superior al percetil 95% de la

distribución total, conforme a lo sugerido por Hirsch et al. (1992) y Ponzanelli et al.

(1997), entre otros.

3.1.3.2.2. Protocolo del ensayo de MN en linfocitos de sangre periférica

Para llevar a cabo el ensayo de MN, transcurridas 44 h desde el inicio de los cultivos se

añadieron 10 μL de Citocalasina B (Cyt B - Sigma) a una concentración final de 6 μg/mL,

con el objetivo de bloquear la citocinesis. La fase se cultivo se termina cuando transcurren las 72 h de incubación. En el paso siguiente, los cultivos se centrifugan a 120 x g por 8 min. Una vez aspirado el sobrenadante, se hace un lavado con medio RPMI 1640 seguido de un choque hipotónico con una solución de KCl a 4 ºC durante 2-3 min. La etapa posterior consiste en la fijación de los cultivos y, después de centrifugados, se elimina el sobrenadante y las células se fijan en una solución fría de metanol/ ácido acético (3:1 v/v). Este procedimiento se repitió dos o tres veces hasta obtener un sobrenadante limpio. La solución celular obtenida se resuspende en una pequeña cantidad de fijador y posteriormente se gotea en portaobjetos previamente limpios. Para cada individuo, se han realizado un mínimo de 2 o más preparaciones, que se secan a temperatura ambiente. Una vez secas, las preparaciones se tiñen con una solución al 10 % Giemsa en tampón fosfato (pH = 6,8) durante 10 min. Después de lavadas y secadas al aire, las preparaciones se sellan utilizando 3 gotas de Entellan y cubreobjetos. La etapa final consiste en codificar todas las preparaciones y realizar el recuento de los MN al microscopio.

Para determinar la frecuencia de células binucleadas con MN (BNMN), así como el número total de MN de cada célula, se analizaron un total de 1.000 células binucleadas con

el citoplasma bien conservado (500 por cada réplica) por cada individuo(fig.7).

Fig. 7. Célula BNMN – linfocitos de sangre periférica.

También se hizo la estima del índice de proliferación celular con bloqueo de la citocinesis (CBPI) utilizando la fórmula propuesta por Surrallés et al. (1995):

CPBI = [MI + 2 MII + 3 (MIII + MIV)] / No _{total de células}

Para ello, se analizaron un total de 500 células, donde MI a MIV corresponden a células con 1 hasta 4 núcleos, respectivamente. Cabe destacar que las células con 3 y 4 núcleos se consideran como equivalentes y correspondientes a la 3ª división mitótica. El CPBI, así como el PRI en el caso de los SCE, también se considera como una medida de citotoxicidad.