CULTIVOS CELULARES

3.10.1 Purificación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de donante sano y separación de células T CD8+_.

La separación de CMSP se realizó según se describe en el apartado 3.2. Tras la centrifugación se recogieron las CMSP, se resuspendieron en medio completo, RPMI 1640 (Bio- Whittaker) suplementado con suero bovino fetal 10%, L-glutamina (2 mM), penicilina (100 unidades/ ml) y estreptomicina (100 mg/ml) (Bio-Whittaker) (RPMIc), a una densidad de 106 _{células/ml, y se incubaron toda la noche en la estufa a}

37ºC, con un 90% de humedad relativa y 5% de CO2. Al día siguiente, se realizó un

lavado de las CMSP con un buffer fosfato salino pH 7.5 PBS1X/ albúmina sérica bovina (BSA) 0.5% /EDTA 2mM, previamente filtrado y desgasificado (tampón de separación). Posteriormente se procedió a la eliminación de células T CD8+, (Magnetic Cell Sorting of Human Leukocytes, CD8 Microbeads) (Miltenyi Biotec), por selección positiva de células T CD8+. Para la separación, las células fueron marcadas magnéticamente con anticuerpos monoclonales frente a CD8 (CD8 Microbeads) y pasadas a través de una columna de separación magnética. Las células marcadas CD8+ se quedaron retenidas en la columna, mientras que las células no marcadas (CD8-) pasaron a su través. Las células T CD8- se resuspendiron en un medio RPMI 1640 completo con (IL-2) (2.5 ng/ ml) y se estimularon con fitohemaglutinina (PHA-Lectin) (2 μg/ml) durante tres días, al cabo de este tiempo, las células fueron directamente utilizadas para los cocultivos celulares, o congeladas en N2 líquido a -70ºC para su posterior utilización.

3.10.2 Tratamiento de las células de donante con Mitomicina.

En los casos donde las células presentadoras de antígeno (CPA) se utilizaron para inducir el crecimiento y la expansión de las células T, fue necesario parar su proliferación. Esto se realizó incubando las CMSP totales durante 30 minutos con mitomicina C a una concentración final de 50μg/ml, seguido de dos o tres lavados en 50 ml de NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 1.47 mM pH 7.4 (PBS 1X), por centrifugación a 450g durante 10 minutos para eliminar el exceso de mitomicina. Finalmente se resuspendieron las células en medio RPMI a una densidad de 107 células/ml, directamente para su utilización en los cocultivos celulares, o bien se

congelaron a -70ºC en SFB suplemetado con 10% DMSO para su posterior utilización.

3.10.3 Purificación de CMSP de paciente LTNP: purificación de células T activadas CD4+CD45RO- y de células memoria T CD4+CD45 RO+.

La separación e incubación de CMSP se realizó según se describe en el apartado 3.2 y 3.10.1. Posteriormente, la purificación de células T CD4+ totales se realizó por selección negativa (Magnetic Cell Sorting CD4+T Cell Isolation Kit II human, (Miltenyi Biotec). Las células T no-CD4+, T-CD8+, T γ/δ, células B, NK, células dendríticas, monocitos y eritrocitos, fueron indirectamente marcadas con un cocktail de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina (contra CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCRλ/δ y glicoporina A), utilizado como reactivo primario, y Microbeads conjugadas con anticuerpos anti-biotina como reactivo secundario. Las células T CD4- quedaron retenidas en la columna magnética del separador, mientras que las células T CD4+ no marcadas pasaron a su través.

Posteriormente se realizó una purificación de las células T CD4+CD45RO+ y TCD4+CD45RO- mediante selección positiva de las células memoria (Magnetic Cell Sorting of Human Leukocytes CD45RO Microbeads, Miltenyi Biotec). Las células memoria, fueron marcadas magnéticamente con CD45RO Microbeads y quedaron retenidas en la columna magnética, mientras que las células T CD4+CD45RO- pasaron a su través. La eficiencia del marcaje, es dependiente del nivel de expresión del antígeno CD45RO. La pureza de las poblaciones celulares enriquecidas fue analizada mediante citometría de flujo.

3.10.4 Marcaje, fijación y análisis de las poblaciones celulares purificadas por citometría de flujo.

Las alícuotas recogidas después de cada purificación fueron lavadas en tampón de separación, centrifugadas a 453g durante 3 minutos, e incubadas con 20 μl de los siguientes anticuerpos (Ac) específicos: anti-CD4 conjugado con ficoeritrina (PE), anti-CD8 conjugado con fluoresceína de isotiocianato (FITC) y, anti- CD45 conjugado con aloficocianina (AFC). En todos los casos se realizaron en paralelo incubaciones de las células con Ac del mismo isotipo como control negativo de especificidad.

La mezcla se incubó en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA), tras la incubación se lavó el exceso de Ac con tampón de separación. Las células fueron fijadas en una solución de paraformaldehído al 1% en PBS. Las muestras fueron conservadas a 4ºC hasta su análisis.

La adquisición y el análisis de los resultados se realizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becto Dickinson, Mountain View, California, EEUU), utilizando el programa de inmunocitometría CellQuest (Becton Dickinson).

El número mínimo de eventos adquiridos para validar el ensayo fue de 20.000 células por muestra.

3.10.5 Co-cultivo de células purificadas de pacientes ancestrales con CMSP de donante sano.

Las células purificadas T CD4+CD45RO- y T CD4+CD45RO+ de los pacientes fueron puestas en RPMI con IL-2 (2.5 ng/ml), y cocultivadas con 10x106 CMSP de donante sano previamente tratadas con Mitomicina C (apartado 3.10.2). El cultivo fue estimulado con PHA-Lectin (2 μg/ml) e incubado a 37º C toda la noche. A las 24 horas, se centrifugó el cultivo a 300g 10 minutos a 4ºC para eliminar la PHA-lectin y se añadió 1x106 de CMSP CD8- estimulados con PHA-lectin durante tres días. El medio de cultivo fue cambiado dos veces por semana y alimentado con 1x106 de CMSP CD8- pre-estimulados. Cada tres días se analizó la presencia de antígeno p24 en el sobrenadante de los cultivos mediante un ELISA.

3.10.6 Medida del antígeno p24 del VIH-1 en sobrenadante de cultivo por ELISA

La medida del antígeno (Ag) p24 se realizó mediante un test inmunológico in vitro para su determinación cualitativa en suero o plasma humanos, así como en sobrenadantes de cultivo celular. Este inmunoensayo de electroquimioluminiscencia “ECLIA” está concebido para su empleo en los analizadores automáticos Roche Elecsys 2010 y en el módulo Elecsys Modular Analitics E170 (Roche Diagnostics). El procedimiento de ensayo incluye los siguientes pasos:

1) Incubación del Ag p24 del VIH presente en 50 µl de muestra, con un anticuerpo monoclonal biotilinado específico contra el Ag p24 del VIH, dicho Ab está marcado con quelato de rutenio formando un complejo tipo “sándwich”.

2) Después de incorporar las micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por interacción entre la biotina y la estreptavidina.

3) La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura, donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador.

4) El software Elecsys procesa automáticamente los resultados comparando la señal electroquimioluminiscente obtenida de la muestra con el valor umbral obtenido previamente en la fase de calibración del AgVIH.