RESUMEN
Las toxinas que causan el síndrome diarreico forman un complejo de compuestos liposolubles, producidos por microalgas, aunque algunos de ellos no generan esa sintomatología (palitoxinas y yesotoxina). La obtención de toxinas a partir de cultivos de los géneros Ostreopsis y Protoceratium, debe permitir el suministro de extractos y de toxinas aisladas con las que establecer característiscas diferenciales de toxicidad entre las distintas toxinas mediante ensayos biológicos (de ratón, con cultivos celulares, enzimáticos) y para estudios sobre metodologías analíticas (separación y detección por cromatografía) sin tener que esperar a que se produzcan episodios tóxicos naturales.
En este trabajo se describe la producción de toxinas, posible liberación al medio de las toxinas y del resto de los parámetros básicos (consumo de nutrientes y biomasa) en condiciones de agitación mecánica y aireación fijas en cultivos de 100 L.
INTRODUCCIÓN
De las 5000 especies de algas fitoplanctónicas marinas conocidas, sólo unas 88, principalmente dinoflagelados, son capaces de producir potentes toxinas (UNESCO 2003), aunque en los últimos años se han ido descubriendo nuevas toxinas, como es el caso de las yesotoxinas, azaspirácidos o palitoxina (Yasumoto & Satake 1998). Éstas pueden ser asimiladas por moluscos bivalvos filtradores y, a través de la cadena alimentaria, pasar al hombre. La mayor parte de las técnicas actuales para su estudio se basa en bioensayos de ratón, muy eficaces, pero poco selectivos, de baja sensibilidad y especificidad. Sin embargo los ensayos funcionales in vitro, cultivos celulares y técnicas cromatográficas son una alternativa más prometedora (Draisci et al. 1999, Ciminiello et al. 2003) y de mayor sensibilidad, permitiendo la detección y cuantificación de toxinas en muestras de pequeño tamaño. Estas técnicas precisan de cantidades importantes de la toxina purificada; debido a las dificultades de adquisición de las mismas a partir de casas comerciales, a que las poblaciones naturales de microalgas nocivas se presentan a menudo en bajas concentraciones y a que no se puede esperar la aparición de un afloramiento natural, se hace necesario el aislamiento de las
especies de interés y la producción masiva de cultivos que nos proporcionen la cantidad necesaria de dicha toxina.
En el presente trabajo se pretende estudiar los siguientes aspectos:
Seguimiento de los parámetros que influyen en la marcha del cultivo en dos géneros de dinoflagelados: Protoceratium reticulatum (planctónico) y Ostreopsis spp (bentónico).
Producción de toxinas a lo largo del cultivo: yesotoxina (P. reticulatum) y ostreocinas y/o palitoxina (Ostreopsis spp.), determinando la concentración de las mismas tanto en la biomasa como en el medio de cultivo.
Figura 1 MATERIAL Y MÉTODOS
Los cultivos se llevan a cabo en tanques de metacrilato (Figura 1) con medio L1 sin silicatos (Guillard & Hargraves 1993) agua de mar base de 34 psu, esterilización mediante hipoclorito (35%) 0,25 mL/L y neutralización con tiosulfato (5%) 0,25 mL/L; ciclo luz: oscuridad (12:12); 80-160 µmol fotón m-2 s-1; P. reticulatum a 17 ºC±1 y Ostreopsis spp a 23 ºC±1, con agitación mecánica a 40 rpm durante una hora al día y aireación continua a razón de 20-30 L/min. con una bomba Millipore. Los inóculos son de unos 5 L en ambos géneros, de forma que en el caso de Protoceratium se inicia el cultivo con 500 células/ mL y el Ostreopsis con 9.12 µg clorofila-a/L.
Cada 3-4 días se toman un volumen del orden de unos 250 mL en Protoceratium y 1 L para Ostreopsis distribuyéndose en diferentes alícuotas para medir los siguientes parámetros: unos 5 mL para medir el pH y la fluorescencia en vivo y que posteriormente se fija con lugol para los recuentos celulares en placa Sedgewedick-Rafter; unos 200 mL que se
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filtran en filtros de fibra de vidrio para retener las células y determinar las YTX en las células (Yasumoto & Takizawa 1997) y el medio filtrado para el consumo de NO3-y PO
43-, con un autoanalizador Scan plus system Skalar, en
ambos cultivos, y la concentración de YTX en el agua (Paz et al. 2004). En el caso de Ostreopsis no se determinan densidades celulares por conteo y a cambio el filtro con las células se extrae con MeOH en el que se determinarán la concentración de Clorofila-a (Chl-a) y las toxinas (Riobó et al. 2004c).
RESULTADOS
Figura 2. Parámetros medidos en los cultivos de 100 L.
En la Figuras 2A y 2D se muestra unos buenos ajustes entre el conteo celular y la clorofila a y la fluorescencia en vivo para Protoceratium y para Ostreopsis respectivamente, ya que el conteo celular en este último caso es imposible debido a la mucosidad que produce ese género dado su carácter bentónico. Las Figuras 2 B y 2E muestran el consumo de los dos nutrientes
básicos NO3-y PO
43-que mantienen un patrón normal en este tipo de cultivos,
llegando a su práctico consumo, en ambos casos, observándose un gran paralelismo entre ambos cultivos y sin que aparezcan fenómenos de stress por nutrientes, ya que las curvas de crecimiento que manifiestan (Figuras 2C y 2F) son normales aún teniendo en cuenta que Ostreopsis se cuantifica en función de la Chl-a.
En el cultivo de P. reticulatum a medida que aumenta el número de células aumenta notablemente la cantidad de YTX en la biomasa, este aumento no es tan pronunciado en el medio aunque muy significativo lo que puede indicar una posible liberación al medio de dichas toxinas.(Figura. 2C).
Figura 3. LC-EM de los extractos de células de P. reticulatum y Ostreopsis spp
En el cultivo de Ostreopsis spp. sólo se cuantifica palitoxina y/o análogos en la biomasa a través de la medida de la actividad hemolítica de los extractos celulares; cuya cantidad aumenta paralelamente con la concentración de Chl-a (figura. 2F); en cambio determinaciones con el mismo método, que es muy sensible, en concentrados del medio libre de células no aparece
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actividad hemolítica. En ambos casos se confirma la identidad de las toxinas a través de análisis de LC-EM (figura.3).
CONCLUSIONES
Se verifica la viabilidad de cultivos de P. reticulatum y Ostreopsis spp. en volúmenes de 100 L. Para Ostreopsis spp. se opta por la determinación de Chl-a extraída con MeOH verificándose su buen ajuste con la fluorescencia en vivo en sustitución de los conteos celulares. El control de la producción de yesotoxina en P. reticulatum se lleva a cabo mediante CL y detección fluorimétrica y el de palitoxina y/o análogos en Ostreopsis spp. a través del ensayo hemolítico.
En el cultivo de P. reticulatum se encuentra toxina tanto en el medio como en la biomasa y en el de Ostreopsis spp sólo en las células. El rendimiento del cultivo de P. reticulatum es de 0,6 mg YTX en el agua y 5,6 mg YTX en la biomasa y en el caso de Ostreopsis spp. 3,8 mg de palitoxina en la biomasa. Se pueden obtener grandes biomasas a partir del cultivo de estas microalgas, para la posterior purificación y aislamiento de toxinas, tanto para estudios toxicológicos como de estándar a nivel analítico.
AGRADECIMIENTOS
A los proyectos PGIDT99-MAR40201 y CICYT REN2001-2959-CO4- 01/MAR por la financiación, al Centro Oceanográfico de Vigo (IEO) por las instalaciones y aportación de las cepas y al IIM de Vigo (CSIC) por su ayuda en los procesos de ultrafiltración.
REFERENCIAS
Ciminiello, P, Dell_Aversano, C., Fattorusso, E., Forino, M., Magno, S., Guerrini, F., Pistocchi, R., Boni, L. 2003. Complex yessotoxins profile in Protoceratium reticulatum from north-western Adriatic sea revealed by LC–MS analysis. Toxicon 42:7-14
Draisci, R., Palleschia, L., Giannettia, L., Lucentinia, L., Jamesb, K.J., Bishopb, A.G., Satake, M., Yasumoto, T. 1999. New approach to the direct detection of known and new diarrhoeic shellfish toxins in mussels and phytoplankton by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A 847:213-21
Guillard, R.R.L., Hargraves, P.E. 1993. Stichochysis immovilis is an diatom, not a chysophyte. Phycologia 32:234-6
Paz, B., Riobó, P., Franco, J.M., Fraga, S. 2004. Extracción y purificación de YTX a partir de cultivos de Protoceratium reticulatum. VIII reunión ibérica sobre fitoplancton tóxico y biotoxinas, La Laguna, Tenerife, p 65-71
Riobó, P., Paz, B., Franco, J.M., Fraga, S. 2004. Palytoxinas en Ostreopsis spp VIII reunión ibérica sobre fitoplancton tóxico y biotoxinas, La Laguna, Tenerife, p 149-57
UNESCO IOC. 2003 Taxonomic Reference List of Toxic Algae.
Yasumoto, T., Takizawa, A. 1997. Fluorometric measurement of yessotoxins in shellfish by high-pressure liquid chromatography. Biosci., Biotechnol., Biochem. 61:1775-7
Yasumoto, Y., Satake, M. 1998. New toxins and their toxicological evaluations. In: Reguera B, Blanco J, Fernández ML, Wyatt (eds) Harmful Algae. Xunta de Galicia & Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, p 461-4
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