14.1 Construcció de les diferents soques delecionades pel gen que codifica per la Bdh1p.
14.1.1 Estratègia per delecionar el gen BDH1.
La deleció es va realitzar per substitució de part de la zona codificant del gen
BDH1 per el gen TRP1 (figura 12).
Es van extreure 361 pb de la zona codificant del gen BDH1 mitjançant digestió del vector pYES2-BDH1 amb l’enzim MluNI. Al seu lloc es va subclonar el gen TRP1
Materials i Mètodes posteriorment tractat amb T4 DNA polimerasa per fer-ne extrems roms. Aquesta nova construcció es va digerir amb KpnI/EcoRI per alliberar un fragment d’aproximadament 1,8 kb que contenia el gen TRP1 flanquejat de dues regions homòlogues als extrems 5’ i 3’ de la zona codificant del gen BDH1. Amb aquest fragment es van transformar les soques FY834 i FY61 i es van seleccionar en medi SMM sense triptòfan. Les colònies que apareixien després de 3-4 díes varen ser aquelles que per recombinació homòloga van substituir el gen original BDH1 pel fragment anterior que contenia el gen TRP1, permetent el creixement de les cèl·lules en el medi sense triptòfan. Els clons apareguts es van replaquejar de nou en medi mínim sense triptòfan per purificar les diferents colònies. EcoRI MluNI KpnI MluNI TRP1 BDH1 MluNI MluNI MluNI KpnI MluNI EcoRI TRP1 Bdh1p (1149 pb) 327 pb aprox. 800 pb 461 pb aprox. 1580 pb EcoRI MluNI KpnI MluNI TRP1 BDH1 MluNI MluNI BDH1 MluNI MluNI BDH1 BDH1 MluNI MluNI MluNI KpnI MluNI EcoRI TRP1 MluNI KpnI MluNI EcoRI TRP1 MluNI KpnI MluNI EcoRI TRP1 Bdh1p (1149 pb) 327 pb aprox. 800 pb 461 pb aprox. 1580 pb
FIGURA 12: Esquema que representa l’estratègia seguida per delecionar el gen BDH1. Es va digerir el gen BDH1 amb l’enzim de restricció MluNI, de manera que s’alliberava un fragment de 361 pb de la zona codificant, i al seu lloc es va subclonar el gen TRP1. Per digestió amb KpnI i EcoRI es va alliberar el fragment amb què es va transformar la soca de llevat FY834. Els fragments que flanquegen el gen TRP1, idèntics al gen BDH1, dirigeixen la recombinació al cromosoma correcte de manera que es substitueix la zona codificant del gen BDH1 del genoma per el gen TRP1.
14.1.2 Anàlisi de les noves soques de llevat.
Un cop es van tenir les colònies purificades es van créixer en 10 ml YPD a 30ºC i 250 r.p.m. durant tota la nit per fer-ne una extracció de DNA genòmic. L’anàlisi de la integració es va fer per PCR i en les mateixes condicions que a l’apartat 12 dels Materials i Mètodes. Es va realitzar un control positiu amb DNA genòmic de la soca original FY834.
Materials i Mètodes
68
Addicionalment, els clons obtinguts de la transformació de la soca FY834 es van créixer en 10 ml YPD a 30ºC i 250 r.p.m. durant tota la nit, es van centrifugar a 3.000 xg durant 10 min i el sediment cel·lular es va llisar amb boles de vidre de 0,5 mm de diàmetre en tampó KH2PO4 20 mM pH 6,8, glicerol 30%, DTT 0,5 mM. Els homogenats
es va analitzar per isoelectroenfoc en sistema de minigel vertical i revelat per activitat BDH. Com a control es va utilitzar la mateixa quantitat de proteïna de la soca WV36- 405[pYES2-BDH1] crescuda en medi mínim en presència de galactosa com font de carboni per induir l’expressió de la Bdh1p.
Les noves soques es van anomenar EG2 (delecionada per el gen BDH1) i FY6160 (delecionada per els gens BDH1 i YAL061W).
14.2 Construcció de les diferents soques delecionades pel gen que codifica per l’Adh2p.
14.2.1. Estratègia per delecionar el gen ADH2.
La deleció es va realitzar per substitució de part de la zona codificant del gen
ADH2 per el gen HIS3 de manera anàloga a la deleció del gen BDH1 (figura 13).
EcoRI HindIII BamHI MluNI HIS3 ADH2 MluNI MluNI HindIII
BamHI MluNI EcoRI
HIS3 Adh2p (1047 pb) 282 pb aprox. 1100 pb 165 pb aprox. 1500 pb EcoRI HindIII BamHI MluNI HIS3 ADH2 MluNI MluNI ADH2 MluNI MluNI ADH2 ADH2 MluNI MluNI HindIII
BamHI MluNI EcoRI
HIS3
HindIII
BamHI MluNI EcoRI
HIS3
HindIII
BamHI MluNI EcoRI
HIS3
Adh2p (1047 pb)
282 pb aprox. 1100 pb 165 pb
aprox. 1500 pb
FIGURA 13: Esquema de l’estratègia seguida per delecionar el gen ADH2. Es va digerir el gen ADH2 amb els enzims de restricció HindIII i MluNI, de manera que s’alliberava un fragment de 600 pb de la zona codificant, i al seu lloc es va subclonar el gen HIS3. Per amplificació per PCR es va obtenir un fragment de 1,5 kb amb que es van transformar les soques de llevat FY834 i EG2. Els fragments que flanquegen el gen HIS3, idèntics al gen ADH2, dirigeixen la recombinació al cromosoma correcte de llevat de manera que es substitueix la zona codificant del gen ADH2 del genoma per el gen HIS3.
Materials i Mètodes Es van treure 600 pb de la zona codificant del gen ADH2 mitjançant la doble digestió del vector pYES2-ADH2 amb MluNI/HindIII. Al seu lloc es va subclonar el gen
HIS3 obtingut per digestió del vector YDpH (Berben i cols., 1991) amb BamHI i posteriorment tractat amb T4 DNA polimerasa per fer-ne extrems roms. En aquest cas per obtenir el fragment lineal d’aproximadament 1,5 kb que contenia el gen HIS3
flanquejat de dues regions homòlogues als extrems 5’ i 3’ de la zona codificant del gen
ADH2, es va fer una reacció de PCR.
L’enzim utilitzat en aquest cas va ser la Taq DNA polimerasa (Biotools), enzim sense capacitat correctora i utilitzat per fer reaccions de comprovació en les que no era necessari obtenir una fiabilitat al 100% a l’hora d’amplificar el producte.
La mescla de reacció es va preparar en un volum final de 100 µl en el tampó Tris- HCl 75 mM, pH 9,0, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 20 mM, MgSO4 2 mM i 1 µl
(aproximadament 10 ng) del vector pYES2-adh2::HIS3 obtingut anteriorment, dNTPs a 200 µM cadascun, els dos encebadors utilitzats per amplificar el gen ADH2 en l’apartat 13 a 1 µM, i 2,5 unitats de Taq DNA polimerasa. Es va realitzar un control negatiu sense afegir DNA motlle en una de les reaccions. Les condicions d’amplificació són les mateixes que en l’apartat 13, canviant el temps de polimerització a 1 min 45 seg.
El producte de PCR obtingut (∼1,5 kb) es va separar en un gel d’agarosa i es va purificar i electroeluir en sacs de diàlisi. Amb aquest fragment es van transformar les soques FY834 i EG2 i es van seleccionar en medi SMM sense histidina. Les colònies que apareixien després de 3-4 dies varen ser aquelles que per recombinació homòloga van substituir el gen original ADH2 pel fragment anterior que contenia el gen HIS3, permetent el creixement de les cèl·lules en el medi sense histidina. Els clons apareguts es van replaquejar de nou en medi mínim sense histidina per purificar les diferents colònies.
14.2.2 Anàlisi de les noves soques de llevat.
Un cop es van tenir les colònies purificades es van créixer en 10 ml YPD a 30ºC i 250 r.p.m. durant tota la nit per fer-ne una extracció de DNA genòmic. L’anàlisi de la integració es va fer per PCR en les mateixes condicions que a l’apartat anterior. Es van
Materials i Mètodes
70
afegir dos controls positius, amb DNA genòmic de les dues soques originals FY834 i EG2.
Les soques de llevat obtingudes es van anomenar FYA2 (delecionades per el gen
ADH2) i EGA2 (delecionades pels gens BDH1 i ADH2).
14.3 Construcció de les diferents soques delecionades per el gen YAL061W.
14.3.1. Estratègia per delecionar el gen YAL061W.
L’estratègia per delecionar el gen YAL061W va ser diferent a les utilitzades anteriorment. En aquest cas es va aprofitar la resistència a la geneticina que li confereix al llevat el gen kanMX4 i es va seguir el protocol establert per Wach i cols. (1998).
Els oligonucleòtids dissenyats foren:
S1. 5’-AAG AAT AAC AAT AAA TTC ATT GAA CAT ATT TCA GAA TGA GAG CGT ACG CTG CAG GTC GAC-3’, i
S2. 5’-GGG ATT AAC ACG AGA ACG TGA GTA CTC AAT CAC AAT CAT GTA TCG ATG AAT TCG AGC TCG-3’.
L’oligonucleòtid S1 hibrida a la regió –35 fins la +8 del gen YAL061W (regió subratllada), mentre que la resta ho fa al MCS del vector pFA6-kanMX4 en la regió descrita a Wach i cols. (1998). En l’oligonucleòtid S2 la regió homòloga al gen YAL061W
és la +1251 fins la + 35 de la regió 3’ no codificant (3’ UTR) (regió subratllada). L’amplificació es va fer amb l’enzim PWO DNA polimerasa en les condicions descrites per Wach i cols. (1998).
El producte de PCR obtingut (∼1,5 kb) es va separar en un gel d’agarosa i es va purificar i electroeluir en sacs de diàlisi. Amb aquest fragment es va transformar la soca FY834 i es va seleccionar en medi YPD + geneticina 200 µg/ml. Les colònies que apareixien després de 3-4 díes varen ser aquelles que per recombinació homòloga van substituir el gen original YAL061W per el fragment anterior que contenia el gen
kanMX4, permetent el creixement de les cèl·lules en el medi amb geneticina. Els clons apareguts es van replaquejar de nou en medi YPD amb geneticina per purificar les colònies i eliminar els falsos positius, més nombrosos degut al propi mètode de selecció.
Materials i Mètodes
14.3.2 Anàlisi de les noves soques de llevat.
Un cop es van tenir les colònies purificades es van créixer en 10 ml YPD a 30ºC i 250 r.p.m. durant tota la nit per fer-ne una extracció de DNA genòmic. L’anàlisi de la integració es va fer per PCR en les mateixes condicions que descriuen Wach i cols. (1998).
Per l’amplificació es van construir nous encebadors, homòlegs a la zona no codificant del gen YAL061W i que disten del codó d’inici i del codó stop uns 100 pb. Els nous oligonucleòtids foren: SEQ1. 5’-TTC TTG AAC CTT GTC ATT GG-3’ (-128 a –98 de la regió 5’ UTR) i SEQ2. 5’-CGA TTG GCT CGA TAA ATG-3’ (+110 a +128 de la zona 3’ UTR). Com que eren reaccions de comprovació es va utilitzar la Taq DNA polimerasa en les condicions descrites per Wach i cols. (1998). Es van realitzar un control positiu amb DNA genòmic de la soca original FY834.
El llistat de totes les soques modificades obtingudes es troba a l’annex, punt 2.1.