Desarrollo de moléculas fluorescentes antígeno-específicas para el estudio y

estudio y caracterización de linfocitos B.

Los linfocitos B como ya se ha explicado anteriormente, son células capaces de secretar anticuerpos en su fase de diferenciación final a célula plasmática. Por otra parte en estadio de linfocito B naive o de memoria expresa en superficie la misma inmunoglobulina, formando el complejo receptor o BCR a través del cual reconocen específicamente antígenos.

Desde el descubrimiento y descripción del BCR, muchos investigadores han centrado sus esfuerzos en el análisis de poblaciones específicas de linfocitos B mediante técnicas de separación celular y citometría de flujo basadas en el uso de moléculas fluorescentes ligadas a antígenos específicos capaces de unirse a su receptor de superficie. La mayoría de las técnicas desarrolladas hasta el momento en esta dirección, pueden ser clasificadas en tres grupos: estudios mediante el uso haptenos, estudios mediante el uso de proteínas o viriones/organismos y por último estudios mediante el uso de epítopos. En la tabla 3, se describen las ventajas e inconvenientes de cada uno de estos sistemas. En todos los sistemas, un fluorocromo, una biotina u otra reactivo es utilizado para detectar el linfocito B unido al antígeno correspondiente.

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Tabla 3. Principales sistemas de detección y estudio de linfocitos B a través del BCR. En la tabla se muestra las características, ventajas y desventajas de los diferentes mecanismos de detección de los linfocitos B.

Los haptenos, son moléculas de pequeño tamaño, como el dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP), frente a los cuales el sistema inmune no responde por su baja capacidad inmunogénica. Sin embargo, cuando estas pequeñas moléculas se asocian a otras moléculas transportadoras

o carriers de mayor tamaño, son capaces de estimular el sistema inmunológico y generar

respuestas específicas frente a estas. Generalmente este tipo de modelos han sido empleados para estudios de la biología de linfocitos B en modelos murinos [190]–[193]. A pesar de la utilidad de este tipo de herramientas para el estudio del desarrollo y funcionamiento del sistema inmune, el hecho de tratarse de moléculas no presentes en patógenos o antígenos autoreactivos, limita bastante su aplicación.

En este sentido, el desarrollo reciente de sistemas de detección mediante el uso de proteínas u organismos patogénicos han supuesto un gran avance en este sentido [194]–[196]. Pese a las ventajas de esta técnica, entre las que hay que destacar que es capaz de analizar la respuesta completa frente a los antígenos nativos presentes en la proteína u organismo, hay que señalar que en muchos casos la presencia de antígenos no relevantes como lípidos de la cápside u otros, incrementaría el ruido de fondo o señal, dificultando el análisis de la respuesta frente a los antígenos de interés.

El desarrollo de técnicas mediante el empleo de epítopos específicos, ha supuesto una solución a este inconveniente, siempre y cuando se trabaje con epítopos lineales donde no se requiera la estructura de la proteína completa. En este sentido, en 2003 el Dr. Newman desarrolló una herramienta de tinción linfocitos B con especificidad anti-dsDNA, principal respuesta implicada en el desarrollo de lupus, demostrando la capacidad de estas moléculas de detectar específicamente linfocitos B anti-dsDNA en ratones [197]. En este caso, las

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moléculas tetraméricas estaban constituidas por péptidos de dsDNA biotinilados y conjugados a moléculas fluorescentes de estreptavidina.

Basándose en la misma metodología, recientemente en el año 2009 la Dr. Betty Diamond, publico un estudio de caracterización fenotípica de poblaciones autoreactivas de linfocitos B anti-dsDNA presentes en la sangre de pacientes afectados de lupus [198]. Este estudio describe la correlación existente entre la presencia de altos niveles de linfocitos B anti-dsDNA y el desarrollo de la enfermedad.

Este tipo de técnicas pese a ser más específicas que el resto, no están exentas de problemas, puesto que introduce problemas de ruido de fondo. En este sentido, y como consecuencia de la alta diversidad del repertorio de anticuerpos, las moléculas de estreptavidina y los fluorocromos pueden ser reconocidos de forma específica por anticuerpos. En ratones ha sido descrita la presencia de linfocitos B anti-ficoeritrina (PE) [199]. Actualmente este problema, ha sido parcialmente solventado mediante el uso de dos fluorocromos diferentes conjugados al epítopo reduciendo así de forma importante el ruido de fondo de la técnica [200].

Por tanto el desarrollo de moléculas de marcaje específico de linfocitos B es interesante y necesario para el seguimiento y estudio de poblaciones de linfocitos B autoreactivos, pues el curso de la repuesta de estas células podría proporcionar información relevante sobre el estado de evolución de la enfermedad, permitiendo el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas.

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Antecedentes del estudio.

8.1

La periferina: proteína de origen neuroendocrino.

La periferina es una proteína clasificada como un filamento intermedio del citoesqueleto de tipo III. En ratones, humanos y resto de mamíferos, se ha descrito su presencia en células del sistema nervioso periférico y algunos subgrupos de células del sistema nervioso central, como neuronas motoras espinales, neuronas de origen sensorial y pequeñas inter-neuronas situadas en el córtex e hipocampo [201]. A nivel patológico, se ha asociado la presencia de agregados de periferina en neuronas motoras de pacientes afectados por esclerosis lateral amiotrófica [202].

Como ya se ha comentado anteriormente la periferina presenta un patrón de expresión neuroendocrino, de forma que se ha descrito también su presencia en células β pancreáticas. La periferina está codificada por un único gen, pero en ratón se han descrito hasta tres isoformas diferentes como resultado del splicing alternativo del RNAm [201]. La isoforma

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mayormente expresada recibe el nombre de Per 58, de 58 KDa, es el resultado del correcto

splicing de todas las regiones intrónicas. La isoforma Per 61, originada por splicing defectivo del intrón 4, se diferencia de la anterior en que contiene una inserción central de 32 aminoácidos y un peso molecular final de 61 KDa. Por último, la isoforma Per 56, con 56 KDa de peso molecular, presenta una región carboxi-terminal más corta debida a una deleción, lo que origina un cambio en la pauta de lectura en la secuencia final de la proteína [203].

8.2

Linfocitos B anti-periferina en el infiltrado de ratones NOD.

A comienzos de los años 90, la periferina fue descrita como un autoantígeno relacionado con la DT1 en ratones NOD [204]. Se observó la presencia de autoanticuerpos y la existencia de una respuesta de linfocitos T frente a esta proteína a las 6 semanas de edad en ratones NOD. Sin embargo, durante muchos años fue considerada como un autoantígeno de poca relevancia, debido a estudios que demostraban la eficacia de otros autoantígenos β pancreáticos (GAD-65, insulina, HSP-60,…) en la prevención de DT1 [205], [206] frente a la ineficacia del tratamiento con periferina [207].

Recientemente un estudio realizado por el grupo de Dr. Verdaguer, ha descrito la presencia de una importante respuesta autoreactiva de linfocitos B frente a elementos del sistema nervioso neuronal de islotes pancreáticos infiltrados. El estudio del patrón de especificidad de estas células concluyo que la mayoría de linfocitos B presentes en el infiltrado de islotes presentan especificad anti-periferina, y prácticamente la totalidad reconocen las isoformas Per 58 y Per 61 de la periferina , lo que hace pensar a los autores en la presencia de un epitopo relevante en la región C terminal de la proteína (Puertas et al. 2007). Por otra parte, el análisis de los reordenamientos genéticos de las cadenas pesada y ligera de las Igs de estos linfocitos B, detectó la presencia de reorganizaciones secundarias como hipermutación somática y cambio de clase en esta población [208], lo que podría indicar que la respuesta de linfocitos anti- periferina está activa durante el proceso de destrucción de islotes pancreáticos y probablemente interaccione con linfocitos T CD4 anti-periferina in situ o en nódulos drenantes potenciando la respuesta autoinmunitaria .

Investigaciones recientes, demuestran como la pérdida de neuronas sensoriales que inervan los islotes pancreáticos previene la insulitis y la diabetes en ratones NOD [123], reforzando la idea de que el ataque a diferentes elementos del sistema nervioso como la periferina podría ser decisivo en el desarrollo de la diabetes tipo 1.

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Por tanto el estudio de la respuesta de linfocitos B anti-periferina desarrollada en ratones NOD podría proporcionar información importante sobre su papel de esta población dentro de la DT1.

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