La mejora genética de la calidad de las hortícolas requiere la evaluación de la variación existente en colecciones de germoplasma de las distintas especies y de la obtenidas por mutagénesis, así como de la evaluación de poblaciones segregantes en los programas de mejora. Esto precisa del análisis de un número elevado de muestras con objeto de identificar genotipos con la composición alterada deseada (Font et al., 2006).
Las metodologías analíticas convencionales para la determinación de carotenoides (cromatografía líquida de alta resolución) y minerales (espectrometría de absorción atómica) en matrices biológicas, muestran un alto grado de precisión en la medida, pero al mismo tiempo presentan grandes inconvenientes, como son el alto coste del análisis, lentitud de la operación, necesidad de personal especializado, destrucción de la matriz analizada, y polución del medio ambiente, debido al uso de reactivos químicos, entre otros.
Estos antecedentes han llevado a la búsqueda de tecnologías analíticas alternativas, que aunque perdiendo precisión en la cuantificación del analito, permitan un muestreo rápido y a bajo coste económico, redundando en una importante descarga analítica para el laboratorio. En este sentido, la Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (Near
Infrared Spectroscopy-NIRS), ha mostrado un alto potencial para la predicción de carotenoides y minerales, tanto en matrices orgánicas como en inorgánicas. En relación a los objetivos de esta tesis, el NIRS viene siendo usado desde hace años en la predicción de carotenoides en frutos de banana (Davey et al., 2009), patata (Bonierbale et al., 2009), raíz de yuca (Sánchez et al., 2014) o en granos como el maíz (Brenna y Berardo, 2004), trigo duro (Edwards et al., 1996) o tritordeo (Atienza et al., 2005). Asimismo, también ha sido demostrado su potencial en el muestreo de minerales en muestras biológicas (Nilsson et al., 1996, Font et al., 2001, 2004a, 2004b, 2005) y en hortícolas de hoja (Villatoro-Pulido et al., 2011). Es por ello una técnica con posibilidades reales de ser empleada como método de muestreo rápido, sencillo y no contaminante en el control de la Seguridad Alimentaria. Las muestras de interés seleccionadas durante el proceso de mejora en base a la predicción NIRS,
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los contenidos predichos, suponiendo una reducción muy importante en el número de análisis efectuados por los métodos de referencia en laboratorio.
La tecnología NIRS se basa en la emisión de un haz de luz sobre la muestra a analizar, la cual en función de su composición, o mejor aún, de la naturaleza de los enlaces presentes en sus moléculas, fundamentalmente de aquellos de tipo –CH, –NH y –OH, interaccionará con ellos absorbiendo una determinada cantidad de radiación electromagnética en el rango del infrarrojo cercano, de 780 a 2500 nm (Shenk et al., 2001).
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Figura 1. NIRS modelo 6500 (Foss-NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.)
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En nuestro estudio utilizamos un sistema espectrofotométrico NIR modelo 6500 (Foss- NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.) (Figura 1). Se trata de un equipo dispersivo, que registra los espectros mediante un barrido de longitudes de onda (cada espectro es el promedio de 32 barridos). El sistema permite un registro rápido del espectro (menos de 1 segundo), en el rango de 400 a 2500 nm con un intervalo espectral de 2 nm. Las muestras liofilizadas molidas (Figura 2) se analizaron por triplicado como log 1/R, (R=reflectancia).
El espectro NIRS está basado en los valores de absorbancia a las diferentes longitudes de onda en el rango espectral considerado, siendo los cambios en la respuesta del espectro NIR proporcionales a los cambios en la concentración de componentes químicos, o en las características físicas de la muestra a analizar (Workman y Shenk, 2004). Cada espectro NIRS contiene una importante cantidad de información, en muchos casos redundante, con superposición de bandas de absorción a lo largo de todo el espectro, lo que dificulta en muchos casos la extracción de información relevante (Shenk et al., 2001). Para extraer la información química relevante de cada muestra es necesario recurrir al uso de pretratamientos de la señal espectral, que permiten separar la información meramente química de las variaciones de origen físico (textura, tamaño, geometría de las partículas, etc.). Los pretratamientos más utilizados son la derivación, y los tratamientos de corrección del efecto scatter o radiación dispersa denominados corrección multiplicativa del efecto del
scatter, Standard Normal Variate (SNV) y Detrend (DT) (Shenk y Westerhaus, 1995a; Naes et al., 2002; Heise y Winzen, 2004).
Para ello se desarrolla unmodelo quimiométrico que relaciona la información espectral de las muestras que constituyen el colectivo de aprendizaje con sus valores para el parámetro en estudio, proporcionados por un método de referencia. Una vez desarrollado el modelo, éste permite predecir el contenido de otras muestras de características similares a las incluidas en el grupo de entrenamiento o calibración. Disponer de un colectivo de calibración que aporte variabilidad, es tal vez uno de los factores más importantes en el desarrollo de ecuaciones NIRS. La variabilidad, en lo posible debe ser tanto espectral como física y química, similar a la que se espera posteriormente encontrar en el análisis de rutina diario de nuevas muestras (Williams y Norris, 2001). Shenk et al., (2001) y Williams (2001) señalan que las características que definen al colectivo de calibración empleado, determinan tanto la estabilidad como la exactitud de las ecuaciones desarrolladas.
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La selección de muestras para constituir el colectivo de calibración puede ser realizada a través del uso de herramientas matemáticas diseñadas para la estructuración de la población y la elección de muestras representativas del colectivo. Así, por ejemplo el software WinISI (Infrasoft Internacional, Port Matilda, PA, EE.UU.) cuenta con los algoritmos CENTER y SELECT, que se basan en la realización de un análisis de componentes principales (ACP), seguido del cálculo de distancias entre los espectros de las distintas muestras en un espacio n-dimensional, a través generalmente de la distancia de Mahalanobis (Shenk y Westerhaus, 1995b, 1996). Al mismo tiempo, estos procedimientos permiten detectar aquellas muestras con comportamiento diferente, denominadas “anómalas” (outliers), cuya anomalía puede ser causada tanto por la información espectroscópica o química.
Para el desarrollo de una calibración existen diferentes métodos de regresión (Martens y Naes, 1989; Burns y Ciurczak, 1992 y 2001), siendo los más utilizados en las aplicaciones cuantitativas NIRS la Regresión Lineal Múltiple (RLM ó MLR), la Regresión por Componentes Principales (RCP o PCR), la Regresión mediante Mínimos Cuadrados Parciales (RMCP o PLS) y la Regresión mediante Mínimos Cuadrados Parciales Modificada (RMCPM o MPLS), siendo éstas dos últimas las más empleadas en aplicaciones agroalimentarias (Shenk y Westerhaus, 1995b, Pérez- Marín et al., 2007).El método de regresión MPLS (Modified Partial Least Squares) es una variante del PLS (transforma una regresión lineal en un nuevo sistema de ordenadas, con una dimensión menor que el espacio original de las variables independientes) y aporta la ventaja de la estandarización, es decir, que los residuos NIRS a cada longitud de onda, son divididos por la desviación estándar de los residuales a esa longitud de onda, antes de calcular el siguiente factor. Se dice que este método es a menudo más estable y preciso que el algoritmo PLS, siendo el número de factores de la regresión seleccionado por validación cruzada (Shenk y Westerhaus, 1995a).
Para determinar la exactitud y precisión de las ecuaciones obtenidas en la calibración de cada componente se llevó a cabo un procedimiento de validación cruzada. Es un algoritmo que selecciona diferentes colectivos de calibración y validación dentro de una población específica. El procedimiento consiste en dividir el colectivo de calibración en grupos (dependiendo del número de muestras). Cada grupo de validación es predicho una vez con la ecuación desarrollada a partir del resto de grupos. El procedimiento se repite hasta que todas las muestras hayan sido predichas
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una vez. Este procedimiento además previene el sobreajuste del modelo (Shenk y Westerhaus, 1995a; Williams, 2001).
Los principales estadísticos que nos informan sobre la calidad de las ecuaciones obtenidas son el coeficiente de determinación R2 (Williams y Norris, 1987), RPD (Ratio
of standard error of performance to standard desviation), que mide la relación entre la desviación típica de los datos de referencia de un determinado constituyente y el error típico de validación cruzada (ETVC) para el colectivo de validación cruzada, y RER (Ratio of standard error of performance to range of standard data), que establece la relación entre el rango de los datos de referencia de un determinado constituyente y el ETVC para el colectivo de validación cruzada, son estadísticos muy útiles usados en la evaluación de aplicaciones NIRS (Williams, 2001).
7. Herramientas de laboratorio para medir el efecto antigenotóxico y