Descripción de los componentes básicos

Name

Klonierungsstrategie

Beschreibung

pRK5-

FKBP51FLAG

Vektor pRK5-SV40PUR geschnitten mit EcoRI und HindIII/blund

cDNA amplifiziert mit FKBP51START und FKBP51STOPFLAG

Expression von FKBP51 fusioniert mit C-terminalen FLAG

pRK5-

FKBP52FLAG

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

cDNA amplifiziert mit FKBP52XhoI START und FKBP52STOPFLAG

Expression von FKBP52 fusioniert mit C-terminalen FLAG

pRK5-FKBP51 Vektor pRK5-SV40PUR geschnitten mit EcoRI und HindIII/blund

cDNA amplifiziert mit FKBP51START und FKBP51END

Expression von FKBP51

pRK5-FKBP52 Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

cDNA amplifiziert mit FKBP52XhoI START und FKBP52END

pRK5-

FKBP51TPR- FLAG

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit EcoRI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP51START und FKBP51TPRMut352/358 rev

2. cDNA amplifiziert mit FKBP51TPRMut 352/358vor und FKBP51STOPFLAG 3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit

FKBP51START und FKBP51STOPFLAG

Expression von FKBP51 mit mutierter TPR-Domäne fusioniert mit C-terminalen FLAG

PRK5-FKBP51- PPIaseFLAG

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP51XhoI START und FKBP51PPIMUTvor

2. cDNA amplifiziert mit FKBP51PPIMUT rev und FKBP51 STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP51XhoI START und FKBP51 STOPFLAG

Expression von FKBP51 mit mutierter PPIase- Domäne fusioniert mit C- terminalen FLAG

PRK5-FKBP52- PPIaseFLAG

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP52XhoI START und FKBP52PPIMUTvor

2. cDNA amplifiziert mit FKBP52PPIMUT rev und FKBP52 STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP52XhoI START und FKBP52 STOPFLAG

Expression von FKBP52 mit mutierter PPIase- Domäne fusioniert mit C- terminalen FLAG

pRK5- FKBP51PPI- 52FLAG (Ch1)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP51XhoI START und 51 PPIrev

2. cDNA amplifiziert mit 51PPI-52 und FKBP52 STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP51XhoI START und FKBP52

Chimäres aus FKBP51 PPIase Domäne (AS 1- ) fusioniert mit C-terminalen Teil von FKBP52

STOPFLAG pRK5-

FKBP52PPI- 51FLAG (Ch2)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP52XhoI START und 52 PPIrev

2. cDNA amplifiziert mit 52PPI-51 und FKBP51 STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP52XhoI START und FKBP51 STOPFLAG

Chimäres aus FKBP52 PPIase Domäne (AS 1- 138) fusioniert mit C- terminalen Teil von FKBP51

pRK5-FKBP51- 52 Cal FLAG (Ch3)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. cDNA amplifiziert mit FKBP51XhoI START und 51vorCalrev

2. cDNA amplifiziert mit 51-52Cal und FKBP52STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP51XhoI START und FKBP52 STOPFLAG

Chimäres aus FKBP51 mit Calmodulin-Bindungs- Domäne von FKBP52 (AS 399-459) fusioniert FLAG- Epitop

pRK5-FKBP51- 52 TPR FLAG (Ch4)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. FKBP51 amplifiziert mit

FKBP51XhoISTART und FKBP51.5 2. Ch3 amplifiziert mit 52-51TPR und FKBP52STOPFLAG

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP51XhoI START und

FKBP52STOPFLAG

Chimäres aus FKBP51 mit TPR-Domäne von FKBP52 (AS 272-389) fusioniert mit FLAG-Epitop

pRK5-FKBP52- 51TPR/Cal- FLAG (ChA)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund 1. FKBP51 amplifiziert mit FKBP51STOPFLAG und 52-51TPR 2. FKBP52 amplifiziert mit FKBP52XhoISTART und FKBP52.5

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit

Chimäres aus FKBP52 mit TPR-Domäne und

Calmodulin-Domäne von FKBP51 fusioniert FLAG- Epitop

FKBP52XhoI START und FKBP52 STOPFLAG

pRK5-FKBP52- 51 TPR FLAG (Ch5)

Vektor pRK5-SV40MCS geschnitten mit XhoI und HindIII/blund

1. FKBP52 amplifiziert mit 51TPR-52 und FKBP52STOPFLAG

2. ChA amplifiziert mit FKBP52XhoISTART und 51TPRrev

3. PCR Produkte aus 1. und 2. mit FKBP52XhoI START und FKBP52 STOPFLAG

Chimäres aus FKBP52 mit TPR-Domäne von FKBP51 (AS 270-387) fusioniert FLAG-Epitop

psiRNAseq1 (seq1)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI

Oligo psiRNAseq1for mit Oligo psiRNAseq1rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Expression Doppelstrang-RNA mit einer Haarschleifen- struktur, wobei der Doppelstrangbereich homolog zu FKBP52 ist psiRNAseq1

mut (seq1mut)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI Oligo psiRNAseq1mut-for mit Oligo psiRNAseq1mut-rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Kontrolle der Spezifität von psiRNAseq4, da Sequenz nicht homolog zu FKBP52 d.h. sollte nicht zu RNAi führen

psiRNAseq3 (seq3)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI

Oligo psiRNAseq3for mit Oligo psiRNAseq3rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Expression Doppelstrang-RNA mit einer Haarschleifen- struktur, wobei der Doppelstrangbereich homolog zu FKBP52 ist psiRNAseq3

mut (seq3 mut)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI Oligo psiRNAseq3mut-for mit Oligo psiRNAseq3mut-rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Kontrolle der Spezifität von psiRNAseq4, da Sequenz nicht homolog zu FKBP52 d.h. sollte nicht zu RNAi führen

psiRNAseq2 (seq2)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI

Oligo psiRNAseq2for mit Oligo psiRNAseq2rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Expression Doppelstrang-RNA mit einer Haarschleifen-

struktur, wobei der Doppelstrangbereich homolog zu FKBP52 ist psiRNAseq2

mut (seq2 mut)

Vektor psiRNA geschnitten mit BbsI Oligo psiRNAseq2mut-for mit Oligo psiRNAseq2mut-rev annealen und in den Vektor ligieren

Plasmid zur Kontrolle der Spezifität von psiRNAseq4, da Sequenz nicht homolog zu FKBP52 d.h. sollte nicht zu RNAi führen

pPROEx- FKBP51FLAG

Vektor pPROEX H1 geschnitten mit NcoI und XbaI

cDNA amplifiziert mit FKBP51HIS-NcoI und FKBP51-FLAG-Xba-STOP

Plasmid zur Aufreinigung von FKBP51FLAG über His-Tag

pPROEx- FKBP52FLAG

Vektor pPROEX H1 geschnitten mit NcoI und XbaI

cDNA amplifiziert mit FKBP52HIS-NcoI und FKBP52-FLAG-Xba-STOP

Plasmid zur Aufreinigung von FKBP52FLAG über His-Tag