Descripción

Los datos iniciales, normalizados y entregados por el laboratorio, son mostrados en una hoja de Excel llamada “DATOS”. Las columnas corresponden a las muestras tumorales y normales, una muestra por columna, mientras que las filas corresponden a los genes, una fila por cada gen.

La muestra tumoral es, como se ha explicado anteriormente, el cociente entre la muestra del pool y la muestra procedente del tumor. Por otro lado se han realizado muestras de control para asegurar la calidad del estudio. Dichas muestras son el cociente resultante entre el pool y las muestras de control (recordar que el pool había sido formado con las muestras de tejido sano de colon de 68 pacientes al azar) y una muestra de tejido sano de un paciente. Las muestras de control son muestras de tejido sano que han sido utilizadas en la elaboración del pool. El proceso que se ha seguido es el mismo que para las muestras de tumorales. Se tiñen con cyanina 3 (color verde) las muestras de tejido normal y con cyanina 5 (color rojo) las muestras del pool.

Para identificar las muestras de control de las tumorales se ha nombrado a las muestras tumorales con el prefijo CT, seguido del número de la muestra (por ejemplo la muestra CT 44 corresponde con la muestra tumoral 44). Las muestras normales van precedidas del prefijo CN seguido del número de la

muestra (por ejemplo la muestra CN 27 corresponde a la muestra normal 27). De las 96 muestras, 7 son normales y 89 tumorales.

Imagen 3.6.Imagen de los datos correspondientes a muestras tumorales Fuente: elaboración propia.

La tabla inicial de la hoja datos de Excel de este estudio consta de 97 columnas (la primera columna corresponde al identificador de los genes y las

otras 96 restantes a las muestras), y 14765 filas (la primera fila son los identificadores de las muestras y las otras 14764 corresponden a los genes).

Los datos facilitados por el Hospital Clínico están recogidos en la hoja de cálculo “Hospital Datos” en la tabla “DATOS HOSPITAL”.

Imagen 3.7. Datos Cedidos por el Hospital Clínico San Carlos de Madrid. Fuente: elaboración propia.

Imagen 3.8. Imagen de los datos de la tabla “DATOS HOSPITAL”. Fuente: elaboración propia.

El objetivo del presente trabajo es el estudio de la variabilidad de las muestras (tumores y controles) de los genes; con el fin de explicar la evolución del tumor a partir de la variación en el perfil de expresión de los genes.

Interesa conocer cuánto varía un gen y cuánto varía cada una de las muestras. Si la expresión del gen fuera constante y no tuviera variaciones, ello significaría que el cociente entre la muestra del pool y la muestra tumoral (o de

control) sería 1; por tanto log(2)0. En cambio si la expresión del gen se modificara de manera significativa en la muestra tumoral, quedaría reflejado en el dato del gen en el tumor, se alejaría del valor cero. Esto podría sugerir que la expresión de ese gen pudiera ser importante en la evolución del tumor.

Se asumirá como hipótesis de partida que cuánto más pequeña sea esta distancia, en valor absoluto, potencialmente será menos peligrosa dicha muestra. Las muestras de control, formadas por tejido sano, deberían tener muy poca variabilidad en relación con las muestras tumorales.

La variabilidad de una muestra puede quedar explicada por tres vías:

 Que muchos genes modifique su expresión de una manera no muy

significativa individualmente.

 Que pocos genes modifiquen su expresión de una manera significativa.

 Que muchos genes modifiquen su expresión de manera significativa.

Por tanto, y con carácter general, diremos que cuánto menos variabilidad tenga una muestra menos malignidad presentará el tumor.

Para calcular la variabilidad de cada una de las 96 muestras se realizan los siguientes pasos:

1. Calcular el valor absoluto. Lo primero a realizar es obtener el valor absoluto de todos los genes de cada una de las muestras, tanto de las

tumorales como de las de control. Se prescinde, por ahora, del signo; pues lo interesante es identificar aquellos genes que expresan una mayor variabilidad. Por tanto, es importante identificar la variación de los genes independientemente que ello implique que estén sobre-expresados o inhibidos.

Los cálculos están realizados en la hoja de cálculo “Datos Hospital” en la tabla “VALORES ABSOLUTOS”

Imagen 3.9.Imagen de la tabla “VALORES ABSOLUTOS” Fuente: elaboración propia.

En esta misma tabla se calcula la variabilidad de cada muestra sumando todas las variabilidades de los genes de una muestra. Estos datos están recogidos en la última fila de la tabla bajo el nombre “SUMATORIO”.

Al ordenar las muestras en función de su variabilidad, las muestras de control están las primeras, pues son las que menos varían. Esto corrobora nuestro supuesto de partida: cuanto más cercanas a cero estén las muestras menos “malignas” son. El que la variabilidad de las muestras de control no sean cero atiende a varias razones:

 La expresión de cada gen está influida, en cada momento, por varios factores como pueden ser la edad, sexo, etc.

 Los genes no tiene un valor de expresión único, sino que; en su estado

normal oscilan dentro de un rango. Lo mismo que sucede, por ejemplo, con los valores del colesterol. Si una persona, en condiciones normales, tiene unos niveles de colesterol entre 160 y 200 mg/dl se dice que su nivel de colesterol es bueno. Si dicho nivel se sitúa entre 200 y 240 mg/dl su nivel de colesterol es Normal-Alto. Por último, si su nivel de colesterol supera los 240 mg/dl tiene un colesterol alto.

Las muestras ordenadas en función de su variabilidad están recogidas en la tabla “VALORES ABSOLUTOS ORDENADOS SEGÚN MERCADO”, perteneciente a la hoja de cálculo “Datos”.

Observando los datos nos se percibe que la diferencia entre la variabilidad de las muestras de control y la variabilidad de las muestras tumorales es considerable. Mientras que la variabilidad promedio de las muestras de control es de 3.783,0022; la variabilidad promedio de las muestras tumorales es de 8.622,1186. El promedio de las muestras tumorales es 2,2791 veces más que el promedio de las muestras de control.

Imagen 3.10. Valores absolutos ordenados según mercado (Muestras normales y tumorales)

Imagen 3.11. Valores absolutos ordenados según mercado (Muestras de control)

Imagen 3.12. Formación de la Cartera de genes. Fuente: elaboración propia.

2. Formación de carteras. El valor de cada gen se divide entre el valor promedio de ese gen en las muestras de control restándole uno.

Valor

1

ij ij ic

z

r

z





Donde: ic

z

es la media del gen i de los controles, de tal forma que

r

ij

Imagen 3.13. Formación de la Cartera de genes. Fuente: elaboración propia.

En esta misma tabla está la fila MERCADO, donde se recoge el sumatorio de todos los genes de cada una de las muestras.

De la misma manera definimos j j 1

c d R d   Donde:



d

_c representa la media para las muestras de control.

En este caso Rj representa la variabilidad, en tanto por uno, de la muestra j respecto a las muestras de control.

3. Obtención de las betas. El siguiente paso es calcular los parámetros estadísticos necesarios para el posterior análisis: media, mediana, varianza, desviación típica y la covarianza entre cada uno de los genes y la fila Mercado.

Este estudio pretende realizar un ajuste lineal entre la variable r que i.

son las variabilidades definidas anteriormente en el gen i en las 96 muestras y R que son las variabilidades totales de cada una de las 96 muestras.

Utilizando el modelo de regresión lineal simple de mínimos cuadrados

ordinarios (M.C.O.), la

r

i. es la variable respuesta (variable dependiente) y R

la variable explicativa (variable independiente). Dicha función queda expresada de la siguiente manera:

1

i i

r



R

Donde:

 R: variable que recoge el sumatorio de las variabilidades de cada muestra

 r : gen i _i

El valor de la beta significa:

 Si i > 1: la variabilidad de ese gen es mayor que la variabilidad del tumor.

 Si _i = 1: que la variabilidad del gen aumenta o disminuye en la misma

medida que lo hace la variabilidad de las muestras.

 Si _i = 0: que no existe relación entre la variabilidad del gen y la variabilidad de las muestras.

Interesa identificar aquellos genes que tengan una variabilidad significativa superior a la de la muestra pues, ello indicaría, que la expresión de esos genes en las muestras tumorales es más alta o más baja (dependiendo de si está sobre-expresado o inhibido) que en las muestras del pool.

En la Hoja “Beta Plantilla” se realizan los cálculos de las betas de los 14764 genes. Para su cálculo se han tomado tanto las muestras tumorales como las muestras de control. Se filtran los genes en función de su beta, retenindo aquellos genes cuya beta es superior a un determinado valor.

A continuación, en una nueva tabla llamada “DATOS REDUCIDOS” se

COMPARADOS” se recoge el valor de los genes aportados por el hospital en valor absoluto.Se realiza el sumatorio de los genes incluidos esta vez en el análisis de cada una de las muestras.

Imagen 3.14. Imagen de la tabla “DATOS REDUCIDOS”. Fuente: elaboración propia.

Imagen 3.15. Imagen de la tabla “DATOS COMPARADOS”. Fuente: elaboración propia.

Se calcula valor promedio de cada uno los genes en las muestras de control. Calculand0 los

r

ij



.

1

ij ij ic

z

r

z



 





, donde:

 z_ij es la media del gen i, cuya beta es superior a 3.6, de los controles, de tal forma que rij representa una “rentabilidad”.

 zic es la media de los controles de los genes cuya beta es superior a 3.6 Del mismo modo se halla Rj:

1

j j c

d

R

d



 





de éstos genes, Donde:

 d es el sumatorio de genes cuya beta ha es mayor a 3.6 de una muestra

 d representa la media para las muestras control de los genes cuya beta

es superior a 3.6.

En este caso R_j representa la variabilidad, en tanto por uno, de la muestra j respecto a las muestras control.

Imagen 3.15. Formación de la Cartera de genes. Fuente: elaboración propia.

In document Técnicas avanzadas de análisis financiero: aplicación al diagnóstico y pronóstico en oncología clínica (página 116-132)