Detección de patógenos de interés en bioterrorismo

Actualmente es posible encontrar en los laboratorios de microbiología clínica ensayos basados en reacciones de biología molecular para la detección de agentes patógenos y susceptibles de ser empleados en acciones de bioterrorismo. El desarrollo de ensayos basados en micromatrices para la detección de este tipo de agentes patógenos, sirvió para la puesta a punto de las técnicas de fabricación, marcaje y reacción que se han empleado posteriormente también en los ensayos con muestras clínicas.

En el proceso de puesta a punto y desarrollo de la metodología necesaria para la realización de este tipo de ensayos, se ha podido observar que la inclusión de las moléculas marcadoras durante el proceso de marcaje tiene repercusiones en la eficiencia de las reacciones de amplificación. Al aumentar la concentración de análogo de nucleótido marcado se observa una reducción en la cantidad de producto de PCR generado. Esto es debido a que los grupos fluorescentes que están incluidos en los análogos de nucleótido presentan impedimentos estéricos en su interacción con la polimerasa lo que lleva a una reducción de la actividad de la misma. Este efecto sobre las reacciones de amplificación debe ser considerado a la hora de diseñar los ensayos puesto que puede provocar la modificación de las condiciones de PCR en aquellos casos en los que se desee pasar un ensayo basado en reacciones de PCR a uno en el que se desee hacer una detección posterior mediante técnicas basadas en micromatrices.

En los ensayos realizados para el diseño de una micromatriz capaz de detectar diversos agentes de interés en bioterrorismo, hay que destacar que fue necesaria la generación de una secuencia quimérica artificial de un fragmento del virus de la viruela para poder realizar los ensayos de validación de los sistemas destinados a su detección. Esta secuencia quimérica se generó mediante un proceso de reacciones de PCR anidadas y posterior clonación y secuenciación. Una selección cuidadosa de las condiciones de PCR y de las concentraciones de los oligonucleótidos empleados permitió simplificar este proceso y su realización en una única etapa.

Los ensayos de validación han demostrado que las micromatrices pueden constituir una herramienta para la detección específica de los agentes de interés empleando reacciones de hibridación. En el caso concreto de los ensayos realizados con muestras problema para la detección de F. tularensis en aguas contaminadas, los resultados observados se confirmaron por reacciones de PCR observándose únicamente un falso negativo en estos resultados. Este resultado se explica porque los análisis se realizaron en unas concentraciones que rozaron las condiciones de dilución límite.

En este trabajo se han puesto a punto protocolos que permiten aplicar estas técnicas para la detección de los agentes de interés a partir de productos de amplificación mediante la extensión de sondas diseñadas para tal efecto. Dentro de este entorno se ha explorado también el desarrollo de sistemas basados en la extensión de cebadores inmovilizados sobre la superficie de las micromatrices. Este tipo de abordaje presenta algunas ventajas e inconvenientes respecto a las técnicas basadas en hibridación. En comparación con las reacciones de hibridación, las reacciones de extensión de cebadores inmovilizados son más rápidas en términos de tiempo, el protocolo de extensión (30 minutos) representa un 25% comparado con el de hibridación (2 horas). Esta reducción de tiempo representa una ventaja en un entorno clínico en el que el factor tiempo es más importante que en los entornos de investigación. El desarrollo de sondas específicas para la realización de los ensayos de extensión de cebadores requiere analizar las características del problema dado que existen dos posibles aproximaciones, una de ellas en la que se emplean terminadores de cadena marcados fluorescentemente y otra en la que se emplean sondas alelo-específicas que son extendidas. En los ensayos realizados durante este trabajo, se ha mostrado que ambas aproximaciones son posibles. La selección de una u otra está determinada por el tipo de experimento que se desea realizar. La utilización de terminadores de cadena presenta como principal inconveniente una menor sensibilidad que la observada en los ensayos de extensión de sondas alelo específicas. Esto es debido a que en el caso de la utilización de sondas alelo específicas se incorpora más de una molécula fluorescente en las sondas inmovilizadas, mientras que en los ensayos en los que se emplean terminadores de cadena esta incorporación está limitada a una única molécula fluorescente por cada una de las sondas inmovilizadas. Este efecto tiene una importancia creciente a medida que se reduce la concentración de muestra que sirve de molde para la reacción de extensión. Hay que tener en cuenta que este tipo de ensayos son isotermos y que a diferencia de lo que sucede en las reacciones de PCR no se producen ciclos de

desnaturalización e hibridación entre la muestra y la sonda. En estos casos la diferencia en la cantidad de marcaje incorporada entre las dos aproximaciones va aumentando a medida que se reduce la concentración de muestra en el ensayo. Durante este trabajo se han intentado algunos ensayos dirigidos a la realización de reacciones de PCR sobre la superficie de la micromatriz o a la utilización de una estrategia con ciclos de desnaturalización/extensión para las reacciones de extensión, pero los resultados de los mismos fueron insatisfactorios (datos no mostrados). Se observó evaporación de las muestras y/o una degradación de la superficie de las micromatrices que provocaba un aumento del ruido de fondo en el ensayo que imposibilitaba la detección de cualquier tipo de señal.