Objetivos y alcance. Este documento se elabora con el objetivo de que todo el personal técnico siga este procedimiento para la correcta ejecución del ensayo de Determinación de la actividad de la enzima colinesterasa en sangre total, en el Depar- tamento de Riesgos Químicos.
Fundamento del método. La técnica se basa en la reacción de hidrólisis enzimática de la acetilcolina bajo la influencia de la enzima colinesterasa, formándose una canti- dad equivalente de colina y ácido acético. La cantidad de ácido acético se determina mediante valoración con solución de hidróxido de sodio 0,01 N, es una medida indirecta para establecer la actividad de la enzima colinesterasa.
Responsabilidades. Es responsabilidad del personal calificado (técnico, ingeniero o licenciado en Química) que labora en el laboratorio, el cumplimiento de este instructivo.
El Jefe de Departamento supervisará su cumplimiento, así como el responsable de la calidad.
Operaciones preliminares. Se realizará la toma de muestra según el PNO. RQ.01.002.
Condiciones de seguridad. Se trabajará con las condiciones de seguridad con los reactivos químicos y las muestras biológicas (según MP.RQ.01) y las del equipamiento, según los instructivos en uso.
Equipos, utensilios y medios de medición: – Tubos de ensayo de 100 X 13 mm. – Pipetas graduadas de 1, 2, 5, 10 mL. – Pipetas Sahli para hemoglobina de 0,02 mL. – Microbureta semiautomática de Bang de 2 mL.
– Baño serológico con control de temperatura (INS.RQ.01.005 o 0,35).
– Lámpara o cualquier dispositivo que permita contrastar el cambio de colora- ción.
– Matraces aforados de 25, 50, 100, 250, 500 y 1 000 mL. Materiales y reactivos:
– Solución de clorhidrato de acetilcolina al 2 % (PNO.RQ.01.003) (4.9.1). – Solución de eserina salicilato o clorhidrato (fisostigmina) al 0,4 % (PNO.
RQ.01.003) (4.9.2).
– Solución de hidróxido de sodio 1 N (mol/L) (PNO.RQ.01.003) (4.9.3). – Solución de hidróxido de sodio 0,05 N (0,05 mol/L) (PNO.RQ.01.003) (4.9.4). – Solución de hidróxido de sodio 0,01 N (0,01 mol/L) (PNO.RQ.01.003) (4.9.5). – Solución de fosfato monobásico de potasio 1/15 M (PNO.RQ.01.003) (4.9.6). – Solución de fosfato dibásico de sodio 1/15 M (PNO.RQ.01.003) (4.9.7). – Solución reguladora de fosfato pH 7,8 (PNO.RQ.01.003) (4.9.8). – Preparación de la solución reguladora pH 7,6 (PNO.RQ.01.003) (4.9.9). – Solución indicadora de bromotimol azul al 0,4 % (PNO.RQ.01.003) (4.9.10). – Solución indicadora de bromotimol azul al 0,2 % (PNO.RQ.01.003) (4.9.11). – Solución de ácido clorhídrico 0,01 N (0,01 mol/L) (PNO.RQ.01.003) (4.9.12). – Solución de cloruro de sodio 0,9 % (suero fisiológico) (PNO.RQ.01.003) (4.9.13). Procedimiento:
Muestras. La muestra puede ser del pulpejo del dedo o lóbulo de la oreja o de la vena, una vez tomada se realizará el análisis antes de las 2 h. Se mantendrán las muestras en refrigeración hasta el momento del análisis.
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Toxicología OcupacionalTécnica operatoria:
– Preparación de la porción de ensayo. De la sangre se toma 0,02 mL (20 µL con una pipeta de Sahli) de sangre, dos veces y se añaden a dos tubos de ensayo, el primero se rotulará “muestra” y el segundo “control”, a los que previamente se añadió 1,5 mL de agua bidestilada. La pipeta se lava varias veces con el agua del tubo, no soplar ni formar burbujas.
– Determinación. Agregar 1,8 mL de la solución reguladora a pH 7,6 al tubo ro- tulado como muestra y 2,2 mL al rotulado como control. Se añaden a los dos tubos 3 gotas de solución indicadora de bromotimol azul al 2 %. Al tubo mues- tra se añaden los mililitros de hidróxido de sodio 0,01 N consumidos en la va- loración de la solución de acetilcolina al 2 % y se colocan todos los tubos en baños María a 37 ºC durante 3 min, para que alcancen equilibrio de esta tem- peratura. Trranscurrido este tiempo, se pone a funcionar el cronómetro y en el tiempo “0” se añade 0,1 mL de acetilcolina al 2 % al primer tubo muestra, 30 s después al segundo tubo muestra, y así sucesivamente. Una hora después del tiempo “0”, agregar 2 gotas de eserina salicilato o clorhidrato al 0,4 % al primer tubo, para interrumpir la hidrólisis fermentativa, mezclar bien y sacar el tubo del baño. Se repite en los demás tubos a intervalos de 30 s exactamente, man- teniéndose el mismo orden descrito antes. A los tubos control se le añaden 2 gota de eserina (fisostigmina). Valorar la muestra añadiendo hidróxido de sodio 0,01 N hasta igualar el color, comparando los colores de los dos tubos contra una lámpara apropiada que permita ver el cambio de coloración con el tubo control. Se anota el resultado de los mililitros gastados.
Expresión de los resultados. Método para los cálculos. La actividad de la enzima colinestarasa (A), se calcula mediante la fórmula:
A (mL gastados de hidróxido de sodio 0,01 N) = V • F donde:
V: Cantidad de hidróxido de sodio 0,01 N consumidos en la valoración de la muestra (mL).
f: Factor de normalidad de la solución de hidróxido de sodio.
Para expresar los resultados en UI/mL se utilizará la fórmula siguiente: A= V • f • 8,33
donde: 8,33 es una constante para expresar en UI/mL.
Aproximación de los resultados. Los resultados expresados como mililitro de hi- dróxido de sodio 0,01 N se aproximarán hasta la centésima, los expresados en UI/mL se aproximarán hasta la décima.
Valores normales. Se consideran normales los valores entre 0,34 y 0,45 mL de NaOH 0,01N o entre 2,8 y 3,7 UI/mL. Casi siempre las muestras se realizan por du- plicados y se promedian para emitir el resultado final. Los resultados de los análisis se informarán en sus respectivas órdenes y, cuando sea una entidad, se realizará un informe según el modelo.
Registro. Es obligatoriedad del técnico anotar en el registro correspondiente a la toma de muestra el número de registro, la fecha, nombre y apellidos del paciente, análisis solicitados, procedencia y cualquier observación necesaria.
En el registro de uso del equipo deberán anotarse los datos de la determinación según PNO.
Es responsabilidad del técnico anotar en el registro de entrada, así como en la orden, el resultado del paciente, si se requiere un informe, el responsable de la calidad deberá confeccionarlo.
Vigencia/periodicidad. Este documento es de carácter permanente hasta tanto no se aprueben otras resoluciones y legislaciones por los organismos rectores de la actividad, y se utilizará cada vez que se realice la determinación de la actividad de la enzima colinesterasa en sangre total.
Aprobaciones:
Nombre y apellidos
Cargo Firma Fecha de
implantación 01/09/2011
Elaborado por: Téc. Clara
Castillo Técnica de Laboratorio Revisado por: Lic. Arelis
Jaime Novas Investigadora Auxiliar Aprobado por: Ing. Heliodora
Díaz Jefa de Departamento