2. Material y Métodos
2.6. Determinación de la actividad telomerasa
La detección de la actividad telomerasa se llevó a cabo empleando el kit comercial
TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA® (Roche). Se trata de una ampliación del mé- todo descrito por Kim et al. (Kim et al., 1994).
Se desarrolla en dos pasos: en un primer paso (elongación y amplificación, pa-
sos 1 y 2; Figura 2.2), la enzima telomerasa añade repeticiones teloméricas
(TTAGGG) al extremo 3’ del cebador sintético biotinilado P1-TS. Estos productos de elongación de la telomerasa son amplificados por PCR usando los cebadores P1- TS y P2, generando así secuencias que difieren de tamaño en 6 pb.
Figura 2.2. Representación esquemática de la determinación de la actividad telome- rasa. Adaptado de https://www.roche-applied-science.com.
En un segundo paso (detección por ELISA, pasos 3 y 4; Figura 2.2), los frag-
mentos amplificados por PCR son desnaturalizados e hibridados con una sonda es- pecífica marcada con digoxigenina (P3), cuya secuencia es complementaria a la de las repeticiones teloméricas. El producto resultante es inmovilizado por medio del ceba- dor P1-TS, marcado con biotina, en los pocillos recubiertos de estreptavidina de una placa de ELISA. El producto resultante inmovilizado es entonces detectado con un anticuerpo anti-digoxigenina (anti-DIG-POD, anti-digoxigenina-peroxidasa; anti-
cuerpo policlonal procedente de oveja) conjugado con peroxidasa. La peroxidasa cataliza la conversión del sustrato cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) en un pro- ducto coloreado (azul), cuya absorbancia es proporcional a la cantidad de ADN te- lomérico añadido por la telomerasa.
2.6.1. Elongación y amplificación.
A partir del extracto proteico extraído de cada una de las muestras tumorales y no tumorales, se dispuso en tubos para PCR el volumen correspondiente a 10-15 μg de proteína. Se añadieron a cada uno de los tubos 25 μl de la mezcla de reacción (tam- pón Tris, cebador P1-TS marcado con biotina, cebador P2, nucleótidos y Taq poli- merasa), hasta completar un volumen final de 50 μl con agua libre de nucleasas. Se ha descrito la existencia en numerosos tejidos de inhibidores de la Taq polimerasa, y los extractos que contienen dichos inhibidores vuelven a ser amplificables tras dilución
(Wright et al., 1995). Por ello el ensayo se realizó también en diluciones 1/10 de los
extractos proteicos de todas las muestras, con el fin de controlar las presencia de inhibidores de la Taq polimerasa, que podían ofrecer resultados falsos negativos.
Como control positivo se utilizó un extracto celular procedente de una línea hu- mana de células de riñón (línea 293) inmortalizadas, que expresaban telomerasa, a una concentración aproximada de 103 células/μl. En un tubo para PCR se incluyeron 3 μl del control positivo, 25 μl de la mezcla de reacción y 22 μl de agua libre de nu- cleasas. Así mismo, se preparó un control negativo: para ello se tomaron 3 μl del control positivo a los que se les añadieron 7 μl de agua libre de nucleasas, la mezcla se incubó durante 10 minutos a 85º C. A continuación, se mantuvo 5 minutos en hielo y se le incorporó 1 μl de enzima ARNasa (0.5 μg/μl; RNase, DNase-free, Ro- che). Finalmente, se incubó durante 30 minutos a 37º C, se le añadieron 25 μl de la mezcla de reacción y 15 μl de agua libre de nucleasas. Con este tratamiento se logró la degradación del componente ARN de la telomerasa, destruyéndose la actividad enzimática.
Todos los tubos se sometieron al siguiente programa en un termociclador (Tabla 2.11).
FASE TIEMPO TEMPERATURA (º C) NÚMERO DE CICLOS
Elongación 10-30 minutos 25 1
Inactivación de telomerasa 5 minutos 94 1
Amplificación Desnaturalización Hibridación Elongación 30 segundos 30 segundos 90 segundos 94 50 72 1-30
Elongación final 10 minutos 72 1
Mantenimiento 4 ∞
Tabla 2.11. Condiciones de PCR para la determinación de la actividad telomerasa.
2.6.2. Detección por ELISA.
Una vez finalizada la PCR, y en nuevo tubo estéril, se incubaron 5 μl del producto amplificado de cada una de las muestras no tumorales y tumorales, así como de los controles, con 20 μl del reactivo de desnaturalización (solución de hidróxido sódico, <0.5%), durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se añadieron 225 μl de la solución de hibridación que incluía la sonda P3, complementaria a las repeticiones teloméricas y marcada con digoxigenina. La mezcla se agitó vigorosa- mente con ayuda de un agitador mecánico, y se transfirieron 100 μl de cada una de las mezclas a cada uno de los pocillos recubiertos con estreptavidina de la placa de ELISA. La placa se cubrió con una lámina autoadhesiva para impedir la evaporación y se incubó durante 2 horas a 37º C con agitación (300 rpm).
Tras la incubación, se retiró la solución de hibridación y cada pocillo de la placa se lavó 3 veces con 250 μl de la solución de lavado 1X. A continuación, se incorporaron a cada pocillo 100 μl del anti-DIG-POD (0.5 U/ml), la placa se cubrió nuevamente con una lámina autoadhesiva, y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambien- te, con agitación (300 rpm). Transcurrido el tiempo, se eliminó la solución y cada uno de los pocillos se lavó 5 veces con 250 μl de la solución de lavado 1X. Finalmente, se añadieron 100 μl del sustrato TMB, previamente atemperado, y la placa cubierta con una lámina autoadhesiva se incubó con agitación (300 rpm) a temperatura ambiente durante 20 minutos, hasta que se observó la aparición de color azul en los pocillos. Sin retirar el reactivo anterior, se adicionaron 100 μl del reactivo de parada (solución de ácido sulfúrico <5%), para detener la reacción. Esto provocó el viraje del color azul a amarillo, lo cual es requerido para lograr la máxima sensibilidad.
Con el programa bioinformático Microplate manager® (Bio-Rad) se midió la ab- sorbancia de cada pocillo a 450 nm, empleando una longitud de onda de referencia de 690 nm. Para la interpretación de los resultados se consideraron “muestras telo- merasa positivas” aquellas en las que la diferencia de las absorbancias (A450nm-A690nm) fue superior a 0.2. El control positivo y el control negativo se consideraron válidos cuando la diferencia de absorbancias fue superior a 1.5 e inferior a 0.2, respectiva- mente.