III. Índice Tablas 11
8. Resultados 117
8.9. Determinación de los cambios de expresión de los receptores α de
ulcerosa activa
Dado que en los resultados de la qPCR los receptores α de GCs e IL-‐10 en monocapas de células Caco-‐2 se mostraron influenciados por la IL-‐10 (ver punto 8.7, figuras 31 B y C), se analizó mediante inmunofluorescencia en biopsias intestinales de pacientes con colitis ulcerosa activa los cambios que aparecen en la presencia epitelial del IL-‐10Rα y del GCRα. Los resultados indican que en los pacientes respondedores hay una menor presencia significativa del GCRα y del IL-‐10Rα respecto a sus homólogos con una respuesta inadecuadamente al tratamiento (Figura 33 A y B). No obstante, durante el transcurso inflamatorio los individuos respondedores incrementan la presencia y difusión de GCRα, aunque no es significativa, a diferencia de lo que ocurre con los no respondedores (Figura 33 A).
Cortico-‐
sensibles resistentesCortico-‐
In te ns id ad d e m ar ca je IL 10 Rα (Ba re m o m ar ca je ) Pre-‐tratamiento Post-‐tratamiento In te ns id ad d e m ar ca je G CR α (Ba re m o m ar ca je ) Pre-‐tratamiento Post-‐tratamiento Cortico-‐
sensibles resistentesCortico-‐
A B
* * *
*
#
#
FIGURA 33: Medias ± ES de las valoraciones de las tinciones por inmunofluorescencia para los GCRα e IL-‐10Rα, en muestras de mucosa cólica procedentes de pacientes con colitis ulcerosa activa, sensibles y refractarios al tratamiento con GCs. Figura A representa los valores de marcaje para GCRα, mientras que la B lo hace para los valores del IL10Rα.
*p≤0.038 vs corticorresistentes; #p≤0.008 vs post-‐tratamiento; Medias ±ES del grupo
control: GCRα 2.4±0.074; IL10Rα 0.95±0.091.
Por lo que hace referencia a la intensidad de la fluorescencia para el IL10Rα, ambos grupos de respuesta a los GCs experimentaron un descenso significativo post-‐tratamiento, aunque más acusado en el grupo de pacientes que no respondieron al adecuadamente (Figura 33 B).
El patrón observado de marcaje para los GCRα y IL-‐10Rα tanto en pacientes como en controles es difuso de forma homogénea (Figura 34) por toda la célula epitelial. A pesar de ello, en la mayoría de pacientes sensibles a los GCs se han distinguido unas agrupaciones de alta intensidad de marcaje y más delimitadas, en las que en ocasiones co-‐localizan los dos receptores. (Figura 35).
FIGURA 34 (página posterior, superior): Marcaje por inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en biopsias de pacientes con CU activa. Se observa un marcaje difuso en el citoplasma de las células epiteliales del intestino tanto para el GCRα (rojo), como para la IL10Rα (verde) El núcleo marcado con DAPI (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
FIGURA 35 (página posterior, inferior): Detalle del patrón observado para la inmunoflourescencia de GCRα e IL10Rα, en pacientes con CU activa y sensibles al tratamiento con glucocorticoides. Se marcaron con anti-‐GCRα (rojo), con anti-‐IL10Rα (verde) y con DAPI el núcleo (Azul). Todas las imágenes están tomadas a un aumento de 630x (las imágenes dentro de los cuadrados blancos corresponden a ampliaciones de las fotografías).
GCRα IL10Rα DAPI Merge GCRα IL10Rα DAPI
DISCUSIÓN
9. Discusión
La respuesta inadecuada a los GCs constituye una de las principales complicaciones en el tratamiento de la EII con una grave repercusión en la curación del paciente. Los GCs son la primera línea terapéutica en la colitis ulcerosa activa, no obstante la corticorrefractariedad puede llegar a afectar más del 30% de pacientes (171, 178). Por ello, conocer los mecanismos implicados en la falta de respuesta a esteroides es básico para mejorar su efectividad. Hasta la fecha, los mecanismos implicados en esta falta de sensibilidad a los corticoides se han relacionado con alteraciones en la expresión del GCR y con disfunciones de los mecanismos de desintoxicación celular (MDR-‐1 y Pgp-‐170) (103, 197). Estos estudios han evidenciado una posible relación de la refractariedad terapéutica con la incapacidad de los esteroides en inducir apoptosis a macrófagos y células T activas, y por consiguiente, con una perpetuación la inflamación en la mucosa intestinal (184, 211). En este sentido, nuestro grupo inició hace unos años una aproximación experimental en pacientes con enfermedad de Crohn para comprender los mecanismos moleculares y celulares implicados en el fracaso terapéutico a esteroides. Este estudio mostró un menor grado de apoptosis en células T y B de la lamina propria intestinal en los pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores (208). En el mismo estudio, también pudimos comprobar que la sensibilidad a los esteroides se asociaba significativamente a la presencia de RNAm de la IL-‐10 en la mucosa intestinal de los pacientes respondedores.
En el presente estudio se muestra la reducción de la apoptosis que sufren las células T CD4+ cuando son activadas vía TCR de forma prolongada en comparación con las activadas de forma breve (Figura 21 A). Este fenómeno, recuerda lo importante que puede llegar a ser el epitelio intestinal en la respuesta terapéutica regulando la entrada excesiva de antígenos luminales. Muchos de los polimorfismos asociados a la predisposición de padecer colitis ulcerosa se relacionan con disfunciones de la barrera a nivel del epitelio (MDR-‐1 , CDH1, HNF4α y MAGI2) (87, 217, 218). La implicación patológica de este funcionamiento erróneo es incluso percibido en los familiares de primer
grado de pacientes con colitis ulcerosa, libres de la enfermedad, que registran un aumento de la permeabilidad intestinal superior a la población sana sin antecedentes de EII (219). Además, la deficiencia de IL-‐10 en ratones también aumenta la permeabilidad intestinal como antesala de la aparición de lesiones intestinales (83). En cambio, si los ratones IL-‐10 (-‐/-‐) son tratados con un inhibidor de la zonulina (AT-‐1001), capaz de disminuir la permeabilidad intestinal, los signos de la colitis se reducen (220). A pesar que la IL-‐10 ejerce funciones inmunoreguladoras y antiinflamatorias en el intestino, polarizando la respuesta inmune celular en la lamina propria hacia la tolerancia (221, 126), evidencias recientes sugieren su capacidad de influir sobre funciones de la inmunidad innata y adaptativa en el epitelio intestinal (222). De hecho, otras citocinas de la familia de la IL-‐10 también ejercen acciones sobre el epitelio en la EII, como la IL-‐22 que participa en la remodelación y recuperación de las lesiones activando STAT-‐3 en las células del epitelio intestinal (223, 224). En consecuencia, parece plausible pensar que una baja expresión de IL-‐10 en la mucosa intestinal facilitaría el contacto de los antígenos luminales con la lamina propria y, por ende, se favorecería la respuesta inadecuada a los corticosteroides en la EII. En cualquier caso, explorar la función de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal representa un reto de especial interés en la colitis ulcerosa.
Los cultivos monocapa de células Caco-‐2 confluentes revelan un hecho destacado y a la vez sorprendente, mientras el TNF-‐α incrementaba significativamente el paso de electrones a través de las monocapas celulares, la presencia conjunta, y no por separado, de IL-‐10 y GCs lo bloqueaba (Figura 23). Esta acción sinérgica no ha sido descrita con anterioridad, a pesar que existen indicios de la capacidad de cada uno de ellos por separado en modular la permeabilidad en condiciones inflamatorias. Así, mientras el tratamiento de IL-‐10 fue capaz de prevenir la pérdida de la ZO-‐1, ocludina y E-‐cadherina en un modelo experimental de nutrición parenteral total (225), los GCs regularon la barrera epitelial del intestino bloqueando la expresión de MLCK y facilitando el cierre de las TJs (226). Sin embargo, en nuestras condiciones, la colaboración entre la IL-‐10 y los GCs no produjo cambios
destacables en el contenido de ZO-‐1, ocludina y MLCK (Anexo 3), ni en la obertura o cierre de las TJ (Figura 32).
Entre las vías de señalización analizadas, la fosforilación de la p38 MAPK mostraba una modulación distinta de su actividad en función de si las monocapas celulares habían sido tratadas con GCs o IL-‐10. De hecho el tratamiento conjunto de GCs e IL-‐10 mantuvo los niveles de fosforilación de p38 MAPK muy por debajo a los alcanzados por la administración de TNFα, pero a la vez sin llegar a niveles tan bajos como los inducidos por GCs (Figura 25A). En relación a esto, estudios en células epiteliales de vías aéreas han demostrado que la inhibición de la p38 MAPK por la dexametasona es ejercida a través de la mitogen-‐activated protein kinase fosfatase-‐1 (227, 228). Por otro lado, la presencia de IL-‐10 estimula la p38 MAPK que reduce el estrés del retículo endoplasmático de las células epiteliales del intestino en condiciones inflamatorias por el bloqueo del eje activating traslocation
factor (ATF)-‐6/glucose-‐regulated protein (grp)-‐78 (62).
La actividad p38 MAPK juega un papel clave en la respuesta inflamatoria en la EII, mostrando un incremento destacado en las mucosas intestinales de estos pacientes (25, 229, 230). Sin embargo, estudios clínicos y experimentales han mostrado resultados contradictorios respecto a la función de p38 MAPK en el intestino. Pacientes de enfermedad de Crohn con una actividad grave muestran una favorable remisión clínica al ser tratados con CNI-‐1493 (231), un inhibidor de la fosforilación p38 MAPK; mientras que en otros estudios no se observa mejoría al inhibir con SB203580 (232). Por otro lado, ratones con colitis inducida con TNBS o DSS empeoran su evolución al ser tratados con distintos inhibidores de la activación de p38 MAPK, a pesar de mostrar signos antiinflamatorios como la reducción de algunas citocinas (233, 234). En cambio,
Hollenbach y cols. comprobaron que la inhibición de p38 MAPK era capaz de
reducir drásticamente la actividad NF-‐kB con la consiguiente mejora de las lesiones intestinales (235). Nuestros resultados indican que la acción conjunta de GCs e IL-‐10 modula la fosforilación de p38 MAPK en las células del epitelio intestinal a un nivel adecuado para reforzar las uniones paracelulares y disminuir ligeramente la producción de IL-‐8 respecto de lo que ocurre con el
grupo tratado con GC en condiciones inflamatorias. Esto sugiere la existencia de distintos niveles de participación de esta quinasa aportando un potencial efecto protector de la línea epitelial. De hecho, incluso la producción autocrina o paracrina de IL-‐8 se han relacionado con la activación de procesos protectores sobre la línea epitelial que favorecen la recuperación de las lesiones (236, 237).
La dicotomía en la actividad de p38 MAPK también ha sido reportada en un excelente estudio con ratones portadores de una deleción en las células mieloides, que resulta en una reducción de la actividad inflamatoria inducida por DSS, mientras que si esta deleción era exclusiva de las células epiteliales se potencian los efectos deletéreos producidos por el modelo (238), corroborando el papel protector de la p38 MAPK en el epitelio. Reforzando esta idea, existen estudios in vitro que han demostrado la participación de p38 MPAK en distintas funciones protectoras sobre el epitelio intestinal controlando el ciclo celular, la autofagia y reforzando la función barrera (239-‐ 242). Se ha demostrado que una cierta actividad de p38 MAPK mediada por probióticos en condiciones inflamatorias refuerzan las TJ (243-‐245), lo que promueve la reepitelización y curación de las lesiones intestinales (241).
Para averiguar el papel de la IL-‐10 sobre p38 MAPK en la adhesión lateral de las células epiteliales del intestino, y por ende, en la respuesta a los esteroides, se realizaron una serie de experimentos in vitro con células Caco-‐ 2 a las que añadimos el inhibidor de la fosforilación de la p38 MAPK, SB203580. En estos ensayos comprobamos que la presencia conjunta de IL-‐ 10 y GCs coincidía con un mayor número de núcleos positivos para p38 MAPK fosforilada (Figura 29) y con un aumento de la TEER, mientras que el bloqueo de la actividad de la p38 MAPK revertía estos indicadores. Por lo tanto, el papel de la fosforilación de p38 MAPK es clave para entender la función de la IL-‐10 en condiciones inflamatorias sobre el epitelio intestinal. En este sentido, la presencia nuclear de la p38 MAPK fosforilada también fue más elevada en las biopsias intestinales previas al tratamiento de pacientes respondedores que en las de los no respondedores (Figura 28), lo que podría suponer mayor capacidad de aislamiento de la lamina propria en los
pacientes sensibles. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que los pacientes corticosensibles tenían un incremento de la expresión de IL-‐10 en la mucosa cólica muy superior a la de los pacientes refractarios antes del tratamiento con GCs (40,0 vs 2,4; p=0,023. Anexo 6) (246). Aunque la evolución del proceso inflamatorio en pacientes no es del todo equiparable a las observaciones in vitro, existen coincidencias sutiles que implican una mayor actividad del eje IL-‐10/MAPK en el epitelio intestinal de los pacientes sensibles a los GCs. Sin embargo, estos resultados han de considerarse con cautela, ya que los grupos según la respuesta terapéutica estuvieron constituidos por un total de 5-‐6 pacientes. De todas formas, la localización nuclear de la forma fosforilada de p38 también ha sido detectada en el epitelio intestinal de pacientes con enfermedad de Crohn activa no respondedores a los esteroides (201). No obstante, la producción intestinal de citocinas en la enfermedad de Crohn es muy diferente al de la colitis ulcerosa (208), donde la expresión de IL-‐10 es diez veces superior. Por consiguiente, con un patrón de activación de p38 MAPK distinto entre ambas entidades de EII. En definitiva, la IL-‐10 aporta una ventaja en la recuperación de la barrera epitelial a través de la activación de p38 MAPK en la colitis ulcerosa activa tratada con GCs. Esta recuperación del epitelio a través del eje IL-‐10/p38 MAPK se concreta en nuestros estudios con un aumento de la TEER y puede llegar a suponer una más eficaz curación de las lesiones.
Dada la poca implicación de las proteínas de las TJ analizadas en el aumento de las uniones paracelulares, exploramos otros mecanismos de adhesión celular. Las cadherinas juegan un importante papel en la regulación de la permeabilidad intestinal, modulando la expresión de Claudina-‐5 y regulando la función de Akt/FoxO (247). En el presente estudio, la IL-‐10 era capaz de aumentar la expresión de la E-‐cadherina de forma independiente a p38 MAPK en las células epiteliales tratadas con GCs en un entorno inflamatorio. El hecho que las cadherinas sean las proteínas más abundantes en las AJ y desmosomas, hicieron pensar que la regulación de la TEER vía p38 MAPK se produjera a este nivel y no a través de las TJ. De hecho, el análisis efectuado por MET puso de relieve que la principal área de desacoplamiento celular se producía a nivel de desmosomas (Figura 32). Los desmosomas son claves en
la regulación de la permeabilidad, de hecho distintos estudios demuestran que el bloqueo mediante anti-‐desmogleína-‐2 o -‐3 (cadherinas desmosomales) son capaces de romper la integridad del epitelio y su función barrera (248-‐250), no obstante la función de p38 MAPK en estos procesos es controvertida.
Por otro lado, es destacable el patrón de expresión del GCRα que coincide con el de la TEER, aumentado por acción del eje IL-‐10/p38 MAPK. Estos datos, junto con evidencias anteriores (226), sugieren una posible asociación entre las acciones antiinflamatorias propias de la activación del GCRα con el fomento de las uniones intercelulares. La expresión de IL-‐10Rα está claramente influenciada por la IL-‐10, pero a diferencia del GCRα, el bloqueo de la fosforilación de p38 MAPK supone un aumento considerable de su expresión. El patrón observado para el IL-‐10Rα, es similar al de SOCS-‐3 e IkBα, y a la vez antagónico al de la producción de IL-‐8. En cualquier caso, la actividad generada por IL-‐10 parece influir en una modulación de la actividad p38 MAPK distinta al bloqueo de esta por SB203580.
La expresión in vitro de los receptores α de IL-‐10 y GCs se contrastó en biopsias de pacientes con colitis ulcerosa. Los receptores se hallaron distribuidos homogéneamente por el citoplasma de las células epiteliales intestinales, pero en los pacientes sensibles al tratamiento aparecían unas agrupaciones adicionales donde co-‐localizaban ambos receptores (Figuras 34 y 35). A pesar que la IL-‐10 incrementa la expresión de ambos receptores en las monocapas celulares, en las biopsias cólicas están incrementados en los pacientes no respondedores. Estos resultados podrían considerarse contradictorios si consideramos que la expresión de la IL-‐10 está muy disminuida en estos pacientes refractarios (Anexo 6). No obstante, en la complejidad del intestino el descenso de actividad en una vía de señalización se suele compensar con feedback que produce un aumento en la expresión de receptores activadores. Esto sugiere una disfunción en la trasmisión de señales a través de IL-‐10Rα y/o GCRα en los pacientes resistentes a los GCs, mientras que en los sensibles las agrupaciones de ambos receptores se asocian a una correcta activación de la señalización intercelular.
En definitiva, este estudio demuestra que la presencia de la IL-‐10 influye sobre el epitelio intestinal reforzando las uniones intercelulares a través de un mecanismo que implica a la fosforilación de p38 MAPK, a la vez que se favorece la expresión de los receptores α de IL-‐10 y GCs. La acción sinérgica sobre el refuerzo paracelular que aparece por acción de la IL-‐10 y los GCs puede favorecer la recuperación del epitelio lesionado en la colitis ulcerosa. Probablemente a través de una disminución del estrés que genera el proceso inflamatorio sobre la célula epitelial. Lo que ayuda a recuperar la homeostasis y aislar la lamina propria de antígenos luminales. Además, los cambios moleculares que afectan a la respuesta frente a los GCs pueden ser detectados en el epitelio intestinal de pacientes con colitis ulcerosa. En todo caso, los resultados alcanzados sugieren posibles dianas en el epitelio intestinal respecto al problema de la respuesta inadecuada a los GCs en la colitis ulcerosa, lo que deberá ser concretado en posterior estudios.
CONCLUSIONES
10. CONCLUSIONES
1. La colaboración entre IL-‐10 y GCs fomenta la unión intercelular del epitelio
intestinal.
2. La activación de p38 MAPK juega un papel importante en el sinergismo
entre la IL-‐10 y los GCs en las células epiteliales del intestino.
3. La consecuencia biológica de esta sinergia es la regulación de la
adherencia intercelular a nivel de desmosomas y, probablemente, modulando la expresión de cadherinas.
4. La presencia de IL-‐10 y GCs no se traduce en un cambio de la cantidad de
proteínas de las TJ en células epiteliales tratadas con TNF-‐α.
5. La acción de la IL-‐10 sobre el epitelio intestinal induce la nuclearización de
la p38 MAPK fosforilada que se evidencia en pacientes con colitis ulcerosa antes del tratamiento con corticosteroides.
6. La IL-‐10 en presencia de GCs modula la expresión del receptor α de los
glucocorticoides y de la IL-‐10, implicando de nuevo la actividad de p38 MAPK.
7. La expresión de ambos receptores es detectada en el epitelio intestinal de
pacientes con colitis ulcerosa mostrando cambios según la respuesta terapéutica.
ANEXO
GCs 72H PD98059 72h GCs + PD98059 72h *# In cr em en to c él ul as T fe no ti po CD 4 + GCs 72H PD98059 72h PD98059 GCs + 72h In cr em en to c él ul as T fen ot ip o CD8 + A # B n.s
Anexo 1: Valores de incrementos de fenotipo, apoptosis, apoptosis y necrosis y células vivas del estudio en linfocitos de sangre periférica de individuos sanos, estimulados vía TCR.
Representación gráfica de la mediana IIQ de los incrementos de las células T con fenotipo CD4+ (Figura A) y con fenotipo CD8+ (figura B), después de 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR.
Los resultados de estos estudios in vitro nos muestran un escaso cambio en los fenotipos celulares según la condición analizada. No existen cambios entre las poblaciones sometidas a estímulo de 24h respecto a las estimuladas durante 72h, excepto en la población de células T CD4+ tratadas con inhibidor y GCs conjuntamente (Anexo 1 A; *p≤0.04 vs 72h). Esta condición también muestra un incremento tanto a las 24h como en las 72h respecto a las células tratadas sólo con GCs (Anexo 1 A; #p=0.044 vs GCs).
GCs 72H PD98059 72h GCs + PD98059 72h In cr em en to a po pt os is cé lu la s T C D 8 + C In cr em en to a po pt os is + nec ro si s d e cél ul as T C D8 + GCs 72H PD98059 72h PD98059 GCs + 72h D n.s n.s
Mediana IIQ de los incrementos de apoptosis (Anexo 1 C) y apoptosis más necrosis (Anexo 1 D) de células T CD8 + a las 24h (boxes blancos) o 72h (boxes negros) de estímulo vía TCR.
GCs 72H PD98059 72h PD98059 GCs + 72h GCs 72H PD98059 72h PD98059 GCs + 72h * * n.s. In cr em en to c él ul as T vi va s CD4 + In cr em en