Determinación de carbamato de etilo

El carbamato de etilo, también denominado uretano (Figura 8), es el éster del ácido carbámico y se encuentra de manera natural en la mayoría de los alimentos fermentados en baja concentración (μg/L). Sin embargo, aún siendo baja su presencia en los alimentos, fue

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reconocido y clasificado en 2007 como probablemente carcinógeno para humanos por la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (Baan et al., 2007).

Figura 8. Molécula de carbamato de etilo.

A lo largo de la historia, este compuesto ha tenido diversas aplicaciones comerciales como la preparación y modificación de amino resinas, como cosolvente para la fabricación de pesticidas y fármacos, y como intermediario químico en la industria textil (IARC, 1974). Además, se ha utilizado como antineoplásico, hipnótico en humanos y anestésico para ratones de laboratorio (Paterson et al., 1946; University of California, 2003).

Fue en 1943 cuando se describió su toxicidad y carcinogenicidad (Nettleleship et al., 1943). A partir de entonces se ha investigado mucho este compuesto, demostrando ser genotóxico y carcinogénico en especies de seres vivos como ratones, ratas, hamsters y monos (Beland et al., 2005; Sakano et al., 2002). Debido a esto y al creciente interés del consumidor por la Seguridad Alimentaria, el estudio de esta molécula, sus posibles vías de formación y técnicas de determinación han aumentado acusadamente.

El carbamato de etilo se forma por la reacción del etanol con diferentes compuestos nitrogenados (urea, citrulina, cianuro de hidrógeno, glicósidos cianogénicos, y otros compuestos N-carbamilados) (Perestelo et al., 2010).

La vía de formación más común, es la a partir de la urea, ésta se encuentra en numerosos alimentos fermentados como el yogurt, queso, pan, bebidas alcohólicas y no alcohólicas (Francis et al., 2002; Larsen, 2006). En el caso del vino, la vía más habitual de formación es la reacción directa de la urea, procedente de la arginina, con el etanol (Schehl et al., 2007) (Eq.1).

(1) NH2CONH2 + C2H5OH = C2H5OCONH2 + NH3

La levadura metaboliza la arginina durante la fermentación de la uva y se forma urea, que reacciona con el etanol, alcanzando concentraciones de mg/L. Esta reacción tiene una cinética moderada a temperatura ambiente (Aresta et al., 2001), sin embargo, puede

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incrementar la formación de carbamato de etilo al aumentar la temperatura (cocción, hervido o tostado).

Otras vías de formación de uretano serían a partir de los productos de descomposición de la urea. Así, la urea se descompone en isotiocianato y cianato en soluciones alcohólico- acuosas entre 60 y 100ºC (Eq.2) (Boulton, 1993), o en amonio y ácido cianhídrico debido a un calentamiento, formándose carbamato de etilo por reacción del acido cianhídrico con el etanol (Eq.3) (Schaber et al., 2004).

(2) NCO¯ + C2H5OH + H+ = C2H5OCONH2

(3) H2NCONH2 = NH4+ NCO¯ = NH3 + HCNO

Además de la formación a partir de la urea, es muy habitual, aunque en menor medida que en el caso anterior, la producción de carbamato de etilo es a partir de citrulina. Ésta tiene lugar en la fermentación maloláctica especialmente al reaccionar con el etanol (Arena et al., 1999) (Eq.4).

(4) NH2COOPO3H2 + C2H5OH = C2H5OCONH2 + H3PO4

Otra manera de formación natural del carbamato de etilo es a partir del anión cianuro. Más de 2000 especies de plantas producen cianoglicósidos y éstos pueden descomponerse en azúcar y cianhidrina, este último compuesto se descompone fácilmente dando cianuro de hidrógeno (Vetter 2000), el cual es un precursor del carbamato de etilo.

Existen otras vías de formación del carbamato de etilo pero son menos comunes y aún poco estudiadas.

A los precursores del carbamato de etilo anteriormente citados, hay que añadir a algunos aditivos utilizados en la elaboración de alimentos, los cuales han demostrado producir carbamato de etilo. Este es el caso del carbonato de dietilo y la azodicarbonamida (Aresta et al., 2001; Schaefer et al., 2003).

A pesar de haberse demostrado sus efectos tóxicos en animales de experimentación, aún no se han observado consecuencias directas en el ser humano y no se ha establecido un único nivel máximo en alimentos a nivel internacional. Canadá fue el primer país en establecer niveles máximos de este compuesto en bebidas alcohólicas, estableciendo en 1985 el límite permitido en 30 μg/L en los vinos de mesa, 100 μg/L en los vinos generosos, 150 μg/L en

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bebidas alcohólicas destiladas, 200 μg/L en el vino de arroz (sake), y 400 μg/L en brandys de frutas y licores (Conacher et al., 1986). A partir de 1988, en Estados Unidos se impuso como norma obligatoria determinar el nivel de carbamato de etilo presente en las bebidas fermentadas. Actualmente en los Estados Unidos el límite en vino está entre los 15-60 μg/L (EFSA, 2007). Por otro lado, el Comité Codex de la FAO/OMS sobre aditivos alimentarios y contaminantes estableció en 1993 un máximo de referencia de 30 μg/L en vinos de mesa. Recientemente, el 2 de marzo de 2010, la Unión Europea publicó unas recomendaciones que recogen la necesidad de tomar medidas para disminuir lo máximo posible los niveles de carbamato de etilo en bebidas espirituosas por debajo de 1 mg/L (European Commission, 2010).

Debido a la creciente preocupación actual por la Seguridad Alimentaria, el carbamato de etilo en los alimentos es un compuesto muy estudiado. Así, ya ha sido descrito en muchos alimentos como el pan, el yogurt, el queso y bebidas alcohólicas como vino, cachaça, cerveza, sidra, ginebra y condimentos como el vinagre (Lim y Lee, 2011; Hasnip et al., 2007; Nóbrega et al., 2011). De estos alimentos, el vino ha sido muy estudiado por diversos autores (Stevens y Ough, 1993; Jagerdeo et al., 2002; Perestrelo et al., 2010), sin embargo, la presencia de uretano en el vinagre se está investigando más recientemente y hay muy poca información (Kim et al., 2000; Lim y Lee, 2011). Al ser el vinagre un producto obtenido mediante doble fermentación, este compuesto puede estar presente bien por provenir del vino sustrato de partida o bien por formarse durante el proceso de elaboración. Algunos autores han comprobado la formación de urea durante la fermentación acética (Maestre et al 2008), lo cual podría conducir a la formación de carbamato de etilo en el vinagre ya que ésta se encuentra favorecida en medio ácido.

Con el fin de la determinación del uretano en los alimentos, se han utilizado y puesto a punto diversas técnicas adaptadas a cada matriz. La extracción líquido-líquido usando diclorometano o acetato de etilo como extractante ha sido utilizada por algunos autores para bebidas (Ma et al., 1995; Kim et al., 2000). Sin embargo, las técnicas de extracción más utilizadas son la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase sólida (SPME). Para ello, se han testado varias columnas o materiales de extracción, siendo las más usadas las de tipo copolímero estireno-divinilbenceno (ENV+) (Jagerdeo et al., 2002; Mirzoian y Mabud, 2006) o las que contienen tierra de diatomea (Lim y Lee, 2011).

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El contenido de carbamato de etilo en los alimentos puede oscilar desde algunos ng/L a cientos de μg/L. Debido a las bajas concentraciones de este éster en la matriz y debido a la posible presencia de moléculas que puedan interferir en su determinación, se hace necesario el uso de técnicas muy sensibles y específicas de análisis. La más usada es la cromatografía gaseosa simple (con columna polar) o multidimensional, ambas con diferentes tipos de detectores (FID, MS, MD/MS, etc.). También se ha utilizado la cromatografía líquida con detector de fluorescencia con un paso previo de derivatización que se empleó para el análisis de sidras (Herbert et al., 2002; Madrera y Suárez, 2009). Un estudio realizado por Abreu et al. (2005) en el que se comparaban las técnicas HPLC y GC-MS, para la determinación de uretano entre varios laboratorios, estableció que las desviaciones más pequeñas entre análisis se obtenían con la técnica GC-MS. Aunque menos utilizada, también cabe mencionar el uso de otros tipos de técnicas tales como espectroscopía FTIR (Lachenmeier, 2005) o HPLC-ESI- MS/MS (Park et al., 2007).

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