Determinación de cinéticas durante la fermentación en reactor de 4.0 L.

Durante el proceso de fermentación a escala de 3.5 L se determinaron las cinéticas de variación del pH, de formación de ácido láctico, de consumo de lactosa y de variación en la viabilidad de Bifidobacterium infantis

ATCC 17930.

Las muestras se recolectaron una vez que la leche de cabra fue inoculada y posteriormente, cada 1.5 horas hasta la finalización del proceso.

Variación de pH. El descenso del valor del pH durante la fermentación fue determinado

potenciométricamente con un potenciómetro Beckman Φ50 Meter, Texas Instruments, Fullerton, CA.

Velocidad de formación de ácido láctico. Se realizó a través de la determinación de la acidez

titulable en términos de ácido láctico. Esta determinación se llevó a cabo de acuerdo al método 947.05 de la AOAC (1990).

Consumo de lactosa como sustrato. Se determinó el consumo de lactosa utilizando el kit para

determinación de lactosa/D-galactosa (Boehringer Mannheim/R-Biopharm) de acuerdo al método 984.15 de la AOAC (1990).

Viabilidad de Bifidobacterium infantis. Para determinar la viabilidad de Bifidobacterium infantis se

realizaron conteos en placas según las normas: NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. Los conteos en placa de las UFC se realizaron de la forma descrita en el apartado 5.9, a excepción del medio de cultivo utilizado. Para estos conteos en placa se utilizó como medio selectivo para Bifidobacterium infantis el medio de cultivo MRS agar (Difco™, Le Pont de Claix, Francia) suplementado con 38 µg/mL de kanamicina (kantrex, Bristol, México, DF) y 0.2 % P/V de cloruro de litio (Fermont, CA) (Lim et al, 1993; Lapierre et al, 1992; Lamoureux et al, 2002).

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5.14. Identificación de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 a través de PCR y

electroforesis.

Para verificar que Bifidobacterium infantis estaba presente en el producto fermentado se implementó un método de PCR que amplifica una secuencia en la región 16S rRNA, la cual es específica para esta especie si se utilizan los oligos BiINF-1 y BiINF-2 (Takahiro et al, 1999).

Los oligos fueron sintetizados por la compañía Alpha DNA (Probiotek, México). Constan de 20 bases cada uno y sus secuencias son las siguientes:

BiINF-1 5’-TTCCAGTTGATCGCATGGTC-3’ BiINF-2 5’-GGAAACCCCATCTCTGGGAT-3’

Previo a la amplificación por PCR se llevó a cabo una lisis enzimática siguiendo el método establecido por Solís (2004) y la extracción de ADN utilizando el kit Perfect gDNA Blood Mini Isolation (Eppendorf, Westbury, NY).

Posterior a la amplificación por PCR se llevó a cabo la técnica de electroforesis para poder visualizar la banda de interés, que corresponde a un producto de amplificación de 828 pares de bases (pb) (Takahiro et al, 1999).

5.14.1. Lisis enzimática.

La lisis enzimática consistió en recuperar por centrifugación (3,500 rpm por 10 minutos) las bacterias contenidas en 10 mL del cultivo de cepa pura de Bifidobacterium infantis (control positivo) y/o del producto fermentado (muestra). Se utilizó una centrífuga IEC HN-SII, International Equipment Co., MA.

El pellet formado después de centrifugar se resuspendió en 180 µL de buffer de reacción (20 mM Tris- HCl, pH 8.2; 2 mM EDTA; 1.2 % Tritón X-100) y se le adicionó 20 µL de una solución de lisozima 10 mg/mL en buffer Tris-HCl pH 8.0. Se incubó a 37°C en un baño de agua (Fisher Scientific Isotemp Water Bath 228, Pittsburgh, PA) por 45 minutos el cultivo de cepa pura y 60 minutos el producto fermentado.

5.14.2. Extracción de ADN.

Una vez se llevó a cabo la lisis enzimática se realizó la extracción de ADN siguiendo el protocolo descrito a continuación: Tomar 20 µL de proteinasa K reconstituida y colocarlos en un tubo Eppendorf. Adicionar 200 µL de producto digerido y 350 µL de solución G1 (buffer detergente); mezclar en vortex (se utilizó un Vortex-Genie 2 VWR Scientific, Scientific Industries, Bohemia, NY) a la máxima velocidad por 5 segundos. Incubar a 70 ±1°C por 10 minutos en baño termostatado utilizando la placa calefactora Thermolyne Mirak™, Iowa, USA; mezclando cada 3 minutos en vortex a la máxima velocidad por 5 segundos.

Posteriormente, centrifugar a la máxima velocidad en una microcentrífuga (Eppendorf, Centrifuge 5415C, Westbury, NY) durante 3 minutos. Recuperar el sobrenadante y colocarlo en un tubo nuevo. Adicionar 200 µL. de solución G2 (mezcla de solución detergente e isopropanol). Mezclar en vortex por 5 segundos a la velocidad máxima y transferir a un nuevo tubo ensamblado a una columna que posee un filtro (que posteriormente se denominará como columna).

Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego centrifugar por 2 minutos a velocidad máxima en la microcentrífuga. Remover la columna y decantar el líquido que queda en el tubo. Colocar de nuevo la columna en el mismo tubo y agregar 600 µL de buffer de lavado (buffer salino). Centrifugar por 1 minuto a la velocidad máxima en la microcentrífuga, remover la columna y decantar el líquido que pasa a través de la misma. Ensamblar nuevamente la columna al tubo y agregarle 400 µL de buffer de lavado. Centrifugar por 3 minutos a la velocidad máxima en la microcentrífuga, remover la columna y colocarla en un tubo nuevo. Adicionarle 200 µL de buffer de elución (10 mM Tris-HCl, pH 9.0) e incubar a 70 ±1°C por 3 minutos. Centrifugar por 1 minuto a la velocidad máxima en la microcentrífuga y desechar la columna. Almacenar el ADN extraído a -20°C hasta el momento de realizar la amplificación por PCR.

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Para verificar la eficiencia del procedimiento de extracción del ADN se midieron las absorbancias a 260 nm (longitud de onda de absorción del ADN) y 280 nm (longitud de onda de absorción de las proteínas) y se determinó la relación de las mismas (A260/280 nm). El valor que indica una extracción del 100% del ADN es de 1.8. Sin embargo, valores entre 1.8 y 2.0 indican una extracción de ADN satisfactoria. Por el contrario valores entre 1.5 y 1.7 son indicadores de la presencia de proteínas remanentes en las muestras y valores mayores a 2.0 indican que hay fragmentación del ADN (Manual del kit Perfect gDNA Blood Mini

Isolation, 2000; PrathapKumar y SureshKumar, 2001).

5.14.3. Amplificación de la región 16S rRNA de Bifidobacterium infantis ATCC

17930por medio de PCR.

Para la amplificación por PCR se llevó a cabo el protocolo reportado por Takahiro et al (1999). En la tabla 11 se muestran los reactivos y concentraciones usados en la reacción de PCR para lograr la amplificación del gen 16S rARN de Bifidobacterium infantis.

Tabla 11. Reactivos para la amplificación del gen 16S rRNA de Bifidobacterium infantis mediante PCR.

Reactivo Concentración inicial del reactivo

Volumen utilizado (µL)

Concentración final en un volumen de 25 µL Agua bidestilada estéril --- * c.b.p. 25 µL

Buffer Tris-HCl pH 8.3 125 mM 2.0 10 mM

Cloruro de potasio 625 mM 2.0 50 mM

Cloruro de magnesio 50 mM 0.75 1.5 mM

Nucleótidos 2.5 mM c/u 2.0 0.2 mM c/u

Oligo BiINF-1 125 picomoles/µL 2.0 250 picomoles

Oligo BiINF-2 125 picomoles/µL 2.0 250 picomoles

ADN templado * * 262 ng

Taq ADN polimerasa 5 U/µL 0.20 1 U

* Cantidades variables y dependientes de la concentración de ADN obtenida en las extracciones. c.b.p.: cuanto basta para.

El programa de amplificación utilizado fue el siguiente: 1 ciclo a una temperatura de 94 °C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos y 72°C por 30 segundos y finalmente 1 ciclo a 72°C por 5 minutos (Takahiro et al, 1999). Se utilizó un termociclador Thermohybaid 28503, UK.

5.14.4. Detección de productos de amplificación por medio de electroforesis

en gel de agarosa.

Los productos de amplificación obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para la detección de la presencia de la secuencia de la región 16S rARN correspondiente a Bifidobacterium infantis. Se preparó gel de agarosa (Gibco, Gaithersburg, MD) al 2 % en buffer TAE 1X (Tris-Ácido acético glacial-EDTA). El gel se tiñó con bromuro de etidio (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) antes de que solidificara (1 µL de bromuro de etidio/21 mL de gel de agarosa).

El gel se colocó en una cámara de electroforesis (Mini Sub DNA Cell, Bio-Rad, USA) y se agregó buffer

TAE 1x hasta cubrir por completo el gel. Se cargaron los pocillos del gel con 6 µL; en el caso de las muestras se colocó una mezcla compuesta de 5 µL del ADN amplificado y 1 µL de buffer de carga azul (Bioline, Boston, MA). El marcador de peso molecular que se utilizó fue el Hyper LadderI (Bioline, Boston, MA), éste no se mezcla con buffer de carga pues ya contiene colorante.

Una vez que se cargaron los pocillos del gel con las muestras y el marcador de peso molecular, se encendió la fuente de poder de la cámara de electroforesis y se aplicaron 70 voltios. Se detuvo la electroforesis hasta que el colorante recorrió aproximadamente tres cuartas partes del gel, en ese momento se desconectó la fuente de poder y se retiró el gel de la cámara. Se colocó el gel en un transiluminador (UV Amersham Biosciencies, Hoefer Macro Vue UV-20, San Francisco, CA) acoplado a una cámara digital (Kodak EDAS 290, CA) y a una computadora (Compaq 5500, Houston Texas). Se observó si en la imagen captada del gel aparecía la banda deseada (a 828 pb) que indicaba la presencia de Bifidobacterium infantis ATCC 17930 en las muestras.

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