Determinación de compuestos del color a Licopeno por espectrofotometría

Referencias: Davis y col. (2003) y Lugasi y col. (2003) Principio

Extracción del licopeno en la muestra utilizando hexano y determinación espectrofotométrica de la absorbancia del extracto a 503 nm.

Materiales y aparatos

• Balanza analítica, Scaltec modelo SBA 31. • Agitador termomagnético. Velp Scientifica.

• Agitador orbital. IKA Labortechik modelo K S501. • Filtros de jeringa de nylon de 0.2 μm, Waters.

• Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz. Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager para Windows 95/NT Jasco.

• Material de vidrio de uso en el laboratorio. • Embudos de separación de 250 mL.

• Cubetas de cuarzo de 3.5 mL. Hëllma tipo 100.600-QG de 1 cm. • Micropipeta 200 μL, Gilson modelo P75085L.

• Micropipeta 1000 μL, Gilson modelo P73845L. Reactivos • Licopeno. Sigma Cód. L9879. • n-Hexano. Panreac Cód. 1220631612. • Etanol 96%. Panreac Cód. 141085.1212. • Acetona Panreac. Cód. 1310077.1612. • 2.6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) 98%. Panreac Cód. 162825.1209. • Agua destilada.

Procedimiento

Se pesan entre 2.5 y 6.0 g de muestra y se llevan a 100 mL con agua destilada. Se somete a agitación y se toma, 1 mL de la solución. Las alícuotas se depositan en tubos de vidrio que son cubiertos con papel de aluminio para evitar la fotooxidación del licopeno.

A continuación, se adicionan 10 mL de la solución de hexano/etanol/acetona (2:1:1 v/v/v), conteniendo 0.05% (w/v) de (BHT) en acetona. Posteriormente, los tubos cubiertos con hielo en escamas, se someten a la acción de un agitador orbital a 180 rpm durante 15 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se adicionan 1.5 mL de agua destilada y se llevan nuevamente a agitación durante 5 minutos. Finalizado los 5 minutos, la fase orgánica superior es recolectada mediante un embudo de separación y desecada con Na2SO4 anhídrido. Se toman 2 mL, se aforan a 5 mL y se filtra mediante filtros de nylon de 0.2 μm. La absorbancia del extracto diluido en hexano se mide a 503 nm, utilizando el espectrofotómetro, frente a un blanco de hexano.

Cálculos

La concentración del licopeno (mg/100 g peso fresco) en las muestras se determina a través de una recta de calibración (R2=0.9998) obtenida a partir de cinco alícuotas de 0.125, 0.25, 0.50, 0.75 y 1 mL de una solución patrón de licopeno (0.05 mg/mL) enrasados a 20 mL con hexano (Figura 26). El coeficiente de variación (CV) del método y la medida obtenidos es de 2.60% y 1.49%, respectivamente (Tabla 9).

R2 _{= 0,9998} 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 mg de licopeno/mL A bs or ban ci a ( 503 n m )

Tabla 9. Coeficientes de variación del método y la medida en la determinación de licopeno mediante espectrofotometría

Muestra mg/100 g materia fresca

1 12.67 12.68 2 12.41 12.51 3 12.86 12.30 4 12.66 12.49 5 12.95 12.62 6 12.95 12.61 7 11.98 12.12 8 12.25 12.68 Promedio 12.59 12.50 DT 0.33 0.19 %CV 2.60 1.49 Método Medida

b. Licopeno y β-caroteno mediante HPLC

Referencias: Sadler y col. (1990), Lugasi y col. (2003) y Pedro y Ferreira (2005) Principio

Determinación de la concentración de licopeno y β-caroteno en una muestra mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa y con detector diodo array.

Materiales y aparatos

• Balanza analítica, Scaltec modelo SBA 31. • Agitador termomagnético, Velp Scientifica. • Filtros de jeringa de nylon de 0.2 μm, Waters.

• Cromatógrafo líquido de alta resolución, que consta de: Bomba para HPLC, Jasco modelo PU-1580.

Detector de multilongitud de onda UV/VIS (diodo array), Jasco modelo MD- 1515.

Horno de columna, Jetstream Plus serie 90305-2.

Inyector manual, Rheodyne con bucle de inyección de 20 μL. Software Borwin Chromatography, Jasco versión 1.50. Software Borwin PDA, Jasco versión 1.50.

Software HSS-2000 control Server, Jasco versión 1.50.

Unidad de gradiente ternario de baja presión (mezclador), Jasco modelo LG- 1580-02.

Unidad LC-Net II/ADC, Jasco.

• Columna Sun Fire C18, de 250 mm x 4.6 mm, empacada con partículas de 5 μm, Waters.

• Precolumna Sun Fire C18, de 20 mm x 4.6 mm, empacada con partículas de 5 μm, Waters.

• Jeringa de 50 μL, SGE.

• Desgasificador, Gastorr modelo 154.

• Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz, Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager para Windows 95/NT Jasco.

• Cubetas de cuarzo de 3.5 mL, Hëllma tipo 100.600-QG de 1 cm. • Material de vidrio de uso en el laboratorio.

• Pipetas pasteur de plástico 1.5 mL. • Picadora, Moulinex modelo D56.

• Micropipeta de 200 μL, Gilson modelo P75085L. • Micropipeta de 1000 μL, Gilson modelo P73845L. Reactivos

• Licopeno. Sigma Cód. L9879. • β-caroteno. Sigma Cód. C-9750.

• n-hexano grado HPLC. Merck Cód. 104391.2500. • Etanol 96%. Panreac Cód. 141085.1212.

• Acetona. Panreac Cód. 1310077.1612.

• 2.6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) 98%. Panreac Cód. 162825.1209. • Metanol grado HPLC. Merck Cód. 106018.2500.

• Tetrahidrofurano (THF) grado HPLC. Panreac Cód. 361736.1611.

• Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua Milipore Milli-Q plus. • Agua destilada.

Condiciones de trabajo

• Fase móvil: una mezcla de metanol/THF/H2O-Milli-Q (67:27:6). • Flujo de trabajo: 2 mL/min.

• Presión de trabajo: 19.8 Mpa. • Modo: Isocrático.

• Longitud de onda de detección: Licopeno: 475 nm.

β-caroteno: 450 nm.

• Temperatura de horno de columna: 30 ºC. Procedimiento

2 g de muestra homogenizada se pesan en un erlenmeyer de 250 mL. Se adicionan 50 mL del solvente hexano/acetona/etanol (2:1:1 v/v/v %) que contiene 2.5% de BHT en acetona. El erlenmeyer se cubre con papel aluminio, se inyecta N2 durante aproximadamente 20 segundos, se cubre con hielo en escamas y se lleva a agitación magnética. Después de 10 minutos de agitación, se adicionan 10 mL de agua destilada y se agita nuevamente durante 5 minutos. Al finalizar la agitación se presentan dos fases, una orgánica y otra acuosa. Una alícuota de 4 mL de la fase orgánica (hexano) fue inmediatamente colectada utilizando pipetas pasteur. Esta alícuota se filtra dos veces a través de un filtro de nylon de 0.2 μm y 20 μL se inyectan en el HPLC. En las Figuras 27 a 29 se recogen los espectros y los cromatogramas del licopeno y el β-caroteno tanto de los patrones como de una muestra de tomate en fresco.

-0.1 0.9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 350 400 500 600 700 A b so rb an ci a Wavelength[nm] 0 0.7 0.2 0.4 0.6 300 400 500 600 Wavelength[nm] A b so rb an ci a A b so rb an ci a 0 0.24 0.1 0.2 350 400 500 600 700 Wavelength[nm] A b so rb an ci a

Figura 27. Espectros del patrón del licopeno (475 nm), β-caroteno (450 nm) y una muestra tomate fresco (475nm)

Tr= 11.30 r Tr=14.60 L ic op en o -C ar ot en o a b

Figura 28. Cromatogramas del patrón de licopeno a 475 nm (a) y β-caroteno a 450 nm (b)

Tr=11.30

Tr=14.58

Figura 29. Cromatograma de una muestra de tomate fresco Cálculos

La cuantificación (mg/100 g de materia fresca) se realiza a partir de la recta de calibrado utilizando los estándares respectivos de licopeno (R2_{=0.9986) y β-caroteno} (R2_{=0.9944). La recta de calibración para el licopeno se obtiene a partir de cuatro alícuotas} de 0.5, 2, 5, 7.5 mL de una solución del patrón (0.02 mg/mL) llevados a 10 mL con hexano, el quinto punto de la recta corresponde a la solución patrón (Figura 30) y la recta de calibración del β-caroteno se construye a partir de cinco alícuotas de 0.5, 1, 2.5, 3.75, y 5 mL de una solución patrón (0.021 mg/mL) enrasados a 50 mL con hexano (Figura 31). Los limites de cuantificación son de 1x 10-8 μg /mL para el licopeno y de 5.98 x 10-5 μg/mL para el β-caroteno. El porcentaje de recuperación es del 103.96% para el licopeno y del 93.75% para el β-caroteno. Los coeficientes de variación del método y la medida obtenidos son de 2.64% y 0.88%, respectivamente, para el licopeno y del 4.24% y 1.49%, respectivamente, para el β-caroteno (Tabla 10).

R2 = 0,9986 0 500000 1000000 1500000 2000000 0 0,01 0,02 0,03 mg de licopeno /mL Ar ea

Figura 30. Recta de calibración del licopeno por HPLC

R2= 0,9944 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 0 0,001 0,002 0,003 mg de -caroteno/mLβ Ar ea

Tabla 10. Coeficientes de variación del método y la medida en la determinación de licopeno y β-caroteno por HPLC

Muestra Licopeno(mg/100 g materia _{fresca )} β-caroteno (mg/100 g _{materia fresca )}

1 14.26 14.89 0.81 0.80 2 15.04 14.85 0.83 0.77 3 15.04 14.84 0.82 0.79 4 15.39 14.89 0.86 0.77 5 14.53 14.55 0.78 0.79 6 14.50 14.79 0.82 0.79 7 15.13 0.75 8 15.11 0.81 Promedio 14.87 14.80 0.81 0.78 DS 0.39 0.13 0.03 0.01 %CV 2.64 0.88 4.24 1.49

método medida método medida

Dado que los parámetros de validación de los métodos de determinación de licopeno (espectrofotometría y HPLC) se consideran adecuados y muy similares, se decide aplicar ambos métodos a siete variedades de tomate en fresco (apartado 4.1.2).

Con los datos obtenidos se calcula la recta de regresión y, tal como se observa en la Figura 32 se obtiene un coeficiente de regresión elevado (R2= 0.9097, p<0.01).

En base a estos resultados se concluye que ambos métodos podrían ser utilizados indistintamente para la determinación del licopeno en tomate.

Figura 32. Regresión lineal entre el contenido de licopeno (mg/100 g de materia fresca) medido por HPLC y por espectrofotometría

3.4.19. Determinación del ácido ascórbico