5. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS TÓXICOS EN MODELOS MURINOS Y LA
5.2 RESULTADOS
5.2.2 Determinación del contenido de proteína en el veneno entero
El contenido de proteína en una suspensión de 100 μL de veneno fue de 1103 μg/mL=1.103 mg/mL, determinado mediante la curva de calibración con BSA según el método de Lowry modificado para determinación en lector de microplacas (Figura 13).
66 La misma muestra cuantificada en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 mediante el
protocolo Protein A260/A280, presentó una absorbancia de 1.085, que equivale a un
contenido de proteína de 1.085 mg/mL=1085 μg/mL. Considerando como valor real el que se
determinó mediante el método estándar de Lowry, el error absoluto en la medición fue de
0.018 mg/ml=18 μg/mL, y el error relativo de 1.6%. No hubo diferencia significativa entre las
medias de las mediciones obtenidas por los dos métodos (prueba t de Student).
Figura 13. Curva de calibración por el método micro Lowry. Se prepararon muestras de BSA de concentración conocida y se determinó la concentración de proteína en una muestra de veneno entero de T. forcipula. La concentración de proteína en la muestra de veneno se determinó también mediante un NanoDrop 2000. El error porcentual con respecto al método estándar de Lowry es menor al 2%, justificando la adopción del NanoDrop 2000 como un método rápido y preciso para cuantificar el contenido de proteína.
5.2.3 Dosis letal 50 (DL50) y neurotoxicidad del veneno entero en ratones
Se realizaron ensayos de toxicidad en ratones CD1 mediante inyección IP y se encontró
que bajo las condiciones experimentales la dosis letal 50 (DL50) fue de 47.86 ±1.01 μg/20 g
67
Dosis (D,
μg/20 g ratón)
Log D
50.1
1.70
X
49.0
1.69
X
X
X
47.9
1.68
X
O
O
O
46.8
1.67
O
Resultados del ensayo
muestras. La tabla 3 muestra los resultados de los nueve experimentos realizados (N´), de los
cuales los últimos siete constituyeron el N nominal.
Tabla 3. Resultados de DL50 por el método de Dixon, 1965. Se realizaron 9 experimentos (N´) variando la dosis D de veneno entero hacia arriba y hacia abajo por un valor igual a antilog 0.01, según el resultado del ensayo previo. Las últimas siete corridas forman el N nominal usado para el cálculo de la DL50. Los resultados de cada
ensayo se representan con X=muerte, O=supervivencia.
La DL50 se estimó mediante ∑
y el error estándar medio como √ ,
donde d=0.01, fue la diferencia entre los niveles normalizados de cada ensayo (logD), y A y C
se tomaron de la tabla correspondiente para N>6.
La neurotoxicidad y los efectos sistémicos del veneno entero se evaluaron, mediante el test
de Irwin en ratones albino suizo cepa CFW, y se observó alteración en 19 de los 33
parámetros evaluados, resultados que se resumen en la tabla 4. Se han destacado en negrita
los parámetros que presentaron alteración observable en la mayoría de animales
experimentales.
El primer signo de intoxicación observado fue la ataxia, manifestada como parálisis de las
68 primeros 5 min posinoculación del veneno, se observó también taquipnea, con piloerección,
inquietud, salivación y lacrimación. Hacia los 15 minutos, los ratones se observaron pasivos,
incrementándose la dificultad para caminar, y se observó ptosis palpebral. Hacia los 20
minutos se observó incremento de la frecuencia respiratoria, pasividad con cambio ocasional
de posición, extremidades posteriores estiradas, actitud temerosa y aparición del signo de
Straub (cola erecta).
Tabla 4. Parámetros evaluados en el Test de Irwin. Se inyectaron ratones albino suizo cepa CFW con 500 μL de agua tipo I como tratamiento control, y volúmenes iguales de 0.5DL50 y la DL50 del veneno entero de Tityus forcipula, vía IP (n=6 para cada tratamiento, 20 g de peso corporal aproximadamente). Los ratones se
dispusieron en cajas plásticas transparentes (20 x 30 x 25 cm) y se registraron los signos de intoxicación a los 15, 30 y 60 min, y a las 12 horas posinoculación, de acuerdo a los protocolos y la lista de chequeo del test de Irwin modificado. En negrita se han destacado los parámetros afectados por la inoculación con veneno entero de
T. forcipula (-SNC=Inhibición de procesos centrales: +SNC=Excitación del sistema nervioso central).
-SNC +SNC Ojos Orejas Efectos
generales
Efectos subjetivos
Ataxia Temblores finos
en el cuerpo Enoftalmia Palidez Salivación
Agresión (excitación, aumento de actividad motora) Analgesia Temblores fuertes en el cuerpo
Exoftalmia Hiperemia Erección de la
cola
Pasivo (Reducción de actividad motora)
Anestesia Fasciculaciones Ptosis
palpebral Cianosis Piloerección Temeroso Parálisis de
extremidades anteriores
Convulsiones Tamaño de la
pupila Micción Muerte necropsia
Parálisis de extremidades posteriores
Saltos Nistagmo Diarrea
Reacción de alarma (Inhibición) Reacción de Alarma (Excitación) Lacrimación Priapismo Movimientos circulares Alteración de frecuencia respiratoria
69 Hacia los 30 minutos los animales se observaron pasivos, con la cola y extremidades
posteriores estiradas, taquipnea y jadeo ocasional. Hacia los 35 minutos se observó
piloerección generalizada, quietud, saltos con dificultad de movimiento y erección marcada
de la cola. Las primeras convulsiones tónicas se observaron hacia los 40 minutos, con
duración de 20 s aproximadamente, y regreso a la pasividad. Hacia los 43 minutos se
observaron deposiciones semisólidas. Las convulsiones se incrementaron hacia los 45
minutos, y a los 60 minutos los animales 1 y 2 murieron, presentando intensa piloerección,
quietud entre las fases convulsivas, extremidades posteriores completamente estiradas hacia
atrás, taquipnea y respiración con jadeo.
5.2.4 Efectos del veneno entero sobre los parámetros hematológicos en ratones
En la tabla 5 se presentan los resultados del análisis de las variables hematológicas en
ratones albino suizo, una hora post-inyección de veneno entero vía IP. Las variables del
leucograma, eritrograma, extendido y glicemia que presentaron diferencias significativas
entre control y veneno (p<0.05) fueron: Recuento de células blancas (WBC), recuento
absoluto y relativo de linfocitos (LYM, LY%), recuento absoluto de granulocitos (GRA),
recuento absoluto de plaquetas (PLT), Anisocitosis plaquetaria (PDWc), neutrófilo relativo,
70 Tabla 5. Resultados del análisis estadístico (t de Student), para las variables de la química sanguínea en ratones albino suizo (n=9, machos, 25 g) tratados con veneno entero de T. forcipula vs ratones inyectados con solución control. Hay diferencia significativa si p<0.05.
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