Materiales y métodos
3.8 Determinación de fluidez de membrana por EPR
La técnica de EPR permite estimar el orden dinámico de membranas utilizando marcadores de espín tanto en LUVs como en células.
3.8.1 Preparación de muestras
3.8.1.1 Cantidad de marcador a incorporar
Para conseguir buena señal de EPR se recomienda que la concentración final de marcador en lípidos de membrana sea de 1% molar para evitar la presencia de marcador libre. El volumen de marcador a incorporar depende de la concentración de la solución stock, que fue provista por Avanti Polar Lipids, (Alabaster, EE.UU.).
Para LUVs:
Se incorporan 3,5 ✔L de una solución stock de n-SASL 8,66 mM en etanol sobre 11,1 ✔moles de lípidos totales.
Para el caso de CSL, se incorporan 2,1 ✔L de una solución stock de 7,05 mM en cloroformo cuando la cantidad total de lípidos a marcar era de 11,1 ✔moles.
Para células UFL-AG-286:
Se estima la cantidad de moléculas de lípidos en una muestra de células y se calcula el volumen de marcador de espín a agregar para que la relación molar marcador/lípido sea de aproximadamente el 1%.
Se determina que el número total de moléculas de lípidos en una muestra de 1x107 células es del orden de 1x1017. Para ello se considera que el área promedio una molécula de lípido es 60x10-20 m2 y que la superficie total de membrana es de 0,03 m2. Como la relación molar marcador/lípidos debe ser
de aproximadamente el 1%, se calcula el volumen de marcador a agregar en función de la concentración de la solución stock disponible. En este caso fue de 0,2 ✔L para n-SASL y 0,18 ✔L para CSL.
3.8.1.2 Vesículas unilamelares (LUVs)
Se prepararon LUVs de colesterol/PC de huevo, sitosterol/PC de huevo y ergosterol/PC de huevo con diferente contenido de esterol: 0, 4, 10, 20 y 40 mol% del esterol/lípidos totales. A cada tipo de LUVs se incorporaron alternativamente 5, 12, 16-SASL o CSL como sonda paramagnética. La mezcla de lípidos en cloroformo se secó bajo nitrógeno y se resuspendió en PBS (pH = 7,4). Los lípidos hidratados se sometieron a agitación por vórtex, y los liposomas multilamelares resultantes se convirtieron en LUVs por extrusión a través de filtros de 100 nm de poro (20 ciclos) a 40ºC. Los lípidos puros fueron provistos por Sigma y Avanti Polar lipids (Alabaster, EE.UU.) y conservados a 20 ºC.
3.8.1.3 Células UFL-AG-286
Incorporación de marcadores n-SASLPara incorporar el marcador de espín en las muestras de células se depositó en un tubo Eppendorf el volumen de marcador calculado según la cantidad de células a marcar, y sobre el tubo se depositaron las células conservadas en el medio de cultivo básico. Se homogeneizó la mezcla y sin incubación se centrifugó y se separó el sobrenadante. Para eliminar el marcador no incorporado, las muestras se lavaron con medio de cultivo base, sin agregado de esteroles, centrifugando a 1.000 rpm durante 3 minutos.
La disminución del tiempo de centrifugación de la muestra de células marcadas de 5 minutos (tiempo original) a 3 minutos, resultó crítica para reducir el tiempo entre la incorporación del marcador y el comienzo del registro del espectro. Es importante que no se superen los 12 o 15 minutos de iniciada la marcación ya que se producen cambios en intensidad de la señal y éstos son dependientes del tiempo. El efecto de moléculas antioxidantes presentes en la membrana celular sería el responsable de la disminución de la señal del marcador en el tiempo.
Incorporación del marcador CSL
La incorporación de este marcador de espín es más dificultosa porque es sólo soluble en cloroformo, tóxico para las células. El volumen de marcador calculado según la cantidad de células a marcar se depositó en el fondo de un tubo de vidrio y se evaporó el solvente con N2 gaseoso. Con el objeto de resuspender el marcador, se agregaron sucesivamente 1 ✔L de la solución alcohólica de lípidos utilizada para preparar la emulsión (libre de alfa-tocoferol), y 10 ✔L de Pluronic F68 al 10%.
La incorporación se facilitó mecánicamente por agitación con un vórtex y sobre esa mezcla se depositaron las células conservadas en 1 mL de medio de cultivo base. Se incubaron 10 minutos a 27°C, y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 3 minutos para separar el sobrenadante. El sobrenadante se reservó para determinar la cantidad de marcador no incorporado a la muestra celular. El pellet celular se lavó con medio de cultivo base para eliminar el exceso de marcador, y se reservó también este último líquido de lavado.
Se determinó por EPR la cantidad de marcador en el sobrenadante, en el líquido de lavado y en el fondo del tubo de muestra donde se efectuó la marcación de las células. Para ello se realizó una extracción con cloroformo, agregando 100 ✔L a cada una de las muestras mencionadas. De la capa orgánica se cargaron 15 ✔L en un capilar para obtener los espectros de EPR, que se midieron en las mismas condiciones que las muestras. Se tomaron además espectros de un capilar vacío y de un patrón compuesto por 2 ✔L de la solución stock de CSL y 100 ✔L de cloroformo.
Este procedimiento se realizó en cada experimento para corroborar efectivamente la cantidad de marcador CSL que entró a las células.
3.8.1.4 Muestras policristalinas
Se prepararon soluciones secas de marcadores n-SASL y CSL diluidos en colesterol y sitosterol. Se disolvieron en cloroformo las cantidades adecuadas para preparar diluciones marcador/esterol 1/100, 1/500 y 1/1.000. Se colocaron las soluciones sobre vidrio de reloj para favorecer la evaporación del solvente y se obtuvieron muestras policristalinas de los marcadores diluidos. También se preparó un depósito seco de los marcadores concentrados 12-SASL y CSL.
3.8.2 Mediciones de EPR
Las muestras se cargaron en capilares de vidrio marca Tecnon (Berisso, Buenos Aires), se sellaron en un extremo y se montaron para la medición en tubos de cuarzo de 4 mm de diámetro exterior.
Los espectros de EPR se registraron a 9,7 GHz (banda X) en un espectrómetro Bruker EMX Plus equipado con una cavidad rectangular, que opera en un rango de temperaturas de 4 a 350 K. La frecuencia de modulación del campo es de 100 kHz y la amplitud del campo de modulación debe mantenerse debajo del 30% de los anchos de línea, para evitar distorsiones de los espectros por sobremodulación. Se sintonizó el campo central en 3.340 G con un barrido de 100 G en 200 segundos. Los espectros se registraron a temperaturas controladas con un criostato de flujo continuo de N2 marca Bruker.