2.3 Determinación de la composición química

Se determinó la composición química porcentual del pellet molido de girasol y de los productos proteicos obtenidos.

Los valores de humedad y cenizas fueron determinados gravimétricamente, utilizando los métodos AOAC 935.29 y AOAC 923.03 (AOAC: Association of Official Analytical Chemists Inc., 1995), respectivamente. El contenido de proteínas se determinó por el método de Kjeldahl (AOAC 920.53) utilizando 5,55 como factor de conversión de nitrógeno en proteínas (http://www.nal.usda.gov). La cuantificación de compuestos fenólicos se realizó mediante espectrofotometría en el UV a 324 nm empleando ácido clorogénico (CGA, Chemika Fluka, Alemania) como patrón, como se detalla en Anexo I. En el caso de pellet molido de girasol, además se determinó el contenido de lípidos por Soxhlet (AOAC 920.39) empleando n-hexano como solvente de extracción; y el de hidratos de carbono totales según el método de Felhing-Causse-Bonnans (AOAC 14023/24), previa hidrólisis de dos horas en medio ácido fuerte, empleando una solución de glucosa 0,5% p/v como patrón. El porcentaje de fibra se calculó por diferencia.

34 I.2.4.- Determinación de componentes antinutricionales

La determinación de actividad ureásica y antitríptica se realizó sobre el pellet molido de girasol y una harina de porotos remojados de soja sin tratamiento térmico, esta última empleada como control positivo.

Determinación de actividad ureásica: La actividad ureásica remanente, de los productos estudiados en presencia de urea en solución, fue determinada según el método AOCS, Ba 9-59 (1980) (Sorgentini y col., 1999). Este es un método indirecto en el que se determina el incremento de pH de la dispersión respecto al blanco (a un tiempo fijo) debido a la formación de amoníaco, que es el producto de la hidrólisis enzimática de la urea. La muestra (200 mg) se dispersó en 10 ml de buffer fosfato de sodio 0,1 M, conteniendo urea 3% p/v (Riedel-deHaën, Alemania) a pH 7. Se incubó a 30°C y luego de 30 minutos se determinó el valor de pH. En las mismas condiciones se realizó un blanco sin urea. En estas condiciones experimentales, la actividad ureásica remanente se expresó como la diferencia de pH entre la muestra y el blanco registrada en un período de 30 minutos de reacción (ΔpH). Esta determinación se realizó por triplicado.

Determinación de actividad antitríptica: Para la determinación de la actividad antitríptica en las muestras se siguió el protocolo descripto por AOCS, Ba 1275 (1995) (Della Gatta y col., 1988). En este método se emplea el sustrato sintético BAPA (benzoil-DL-arginina-p-nitroanalida hidrocloruro), el cual es hidrolizado por la tripsina produciendo p-nitroanilina, un compuesto de color amarillo, cuya producción se puede seguir por medida de la absorbancia a 410 nm. La presencia de inhibidores de tripsina (actividad antitríptica), en una muestra de interés, se puede evaluar midiendo la disminución de velocidad de conversión de BAPA en p-nitroanilina cuando se emplea una cantidad fija de la enzima comercial.

Procedimiento para las muestras: Se pesó 1 g de muestra, se le agregó 50 ml de NaOH 0,01N, se incubó con agitación durante tres horas a temperatura ambiente. Luego se

35 tomaron alícuotas del extracto, de las que se separaron los sobrenadantes por centrifugación (23700 xg, 10 minutos a 20°C; Avanti J-25, Beckman Coulter, California, Estados Unidos). Se colocaron 400 µl del extracto (con 1 mg proteína/ml) en un tubo, se agregaron 400 µl de una solución 20 ppm tripsina (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Estados Unidos) en HCl 0,001M. Posteriormente se adicionó 1 ml de una solución 40 ppm BAPA (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Estados Unidos) en buffer Tris 0,05M, pH 8,2, CaCl2 25 mM. Se incubó a 37°C y se agitó ocasionalmente. Luego de 10 minutos, para

detener la reacción enzimática se agregaron 200 µl de ácido acético 30% v/v y se midió la absorbancia a 410 nm (Absm).

Procedimiento para el blanco de la muestra: Se colocaron 400 µl del extracto (con 1 mg proteína/ml) en un tubo y se agregó 1 ml de sustrato BAPA. Se incubó a 37°C durante 10 minutos, luego se agregaron 200 µl de solución de ácido acético 30% v/v y 400 µl de la solución de enzima. Posteriormente se midió la absorbancia a 410 nm (Absbm). Este

valor corresponde a la hidrólisis no enzimática del sustrato. La diferencia entre los valores de absorbancia de la muestra y el blanco de la muestra (Absm– Absbm), luego

de 10 minutos de reacción enzimática, nos indica la actividad residual de la tripsina (AbsrT) en las condiciones del ensayo.

Procedimiento para obtener la actividad tripsina total: Se colocaron 400 µl de NaOH 0,01N en un tubo, se agregaron 400 µl de la solución 20 ppm de enzima y 1ml de sustrato BAPA. Se mantuvo a 37°C durante de 10 minutos, posteriormente se adicionaron 200 µl de solución de ácido acético 30% v/v, y se midió la absorbancia a 410 nm (AbsAT). Este valor de absorbancia determina la actividad máxima de la tripsina,

luego de 10 minutos de reacción enzimática.

La actividad antitríptica (AAT) se expresó como la diferencia entre las absorbancias máxima y residual (AbsAT – AbsrT), luego de transcurridos 10 minutos de reacción

enzimática, en las condiciones del ensayo.

36 I.2.5.- Solubilidad de proteínas y fenoles en función del pH

Se pesaron aproximadamente 10 g de pellet molido de girasol y se dispersaron en 200 ml de agua destilada. Se agitó durante treinta minutos, se midió el pH de la suspensión obtenida y se mantuvo con agitación constante por un período de una hora. Se agregó NaOH (2N) o HCl (2N) para ajustar el pH en el valor deseado, se registró el volumen de solución agregado, se mantuvo con agitación durante treinta minutos y se verificó el pH. Se extrajo un volumen de dispersión que fue registrado. La dispersión se centrifugó a 23700 xg durante 15 minutos a 20°C (Avanti J-25, Beckman Coulter, California, Estados Unidos). En el sobrenadante se cuantificaron proteínas solubles por el método de Bradford (Bradford, 1976) y compuestos fenólicos por espectroscopía en el UV a 324 nm (Anexo I). Como patrones se emplearon seroalbúmina bovina (BSA, Sigma- Aldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) y ácido clorogénico (CGA, Chemika Fluka, Alemania), respectivamente.

También se determinó la solubilidad de proteínas y fenoles en agua a pH 8,25 de los concentrados y aislados siguiendo la metodología descripta anteriormente.

Los resultados se expresaron como porcentaje respecto a la cantidad de proteínas o fenoles presentes originalmente en el material de partida. Las determinaciones se realizaron al menos por duplicado.