Determinación de la degradación del radioligando.

Para comprobar la cuantía de la degradación del radioligando en presencia de la

preparación de membranas se comparó la radiactividad precipitable por ácido

tricloroacético (TCA) en ausencia y en presencia de membranas tras el periodo de incubación. Para ello se prepararon tubos que contenían radioligando, tampón KRP y tampón KRP-BSA. Transcurrido el periodo de incubación se reunió el sobrenadante de

varios tubos B0, se pipeteó en una serie de tubos 150 pl de este sobrenadante y en otra serie de tubos 150 pl del contenido de los tubos con radioligando y tampón, se añadieron 150 pl de TCA al 10% (p/v) a cada tubo, se agitaron y se centrifugaron a 3000 rpm (Minifuge T, Heraeus) durante 10 minutos. Finalmente se aspiró el sobrenadante y se contó el precipitado en el contador de radiactividad gamma.

El resultado se expresa como tanto por ciento de radiactividad presente en el precipitado de los tubos con membranas con respecto a la radiactividad de los tubos sin membranas.

2.8.5. Caracterización del ligamiento de IGF a preparaciones de membrana

plasmática.

Previamente a los estudios de ligamiento se realizaron algunas pruebas para establecer las condiciones experimentales más adecuadas. Para estas pruebas se utilizaron preparaciones de membrana plasmática de hígado y cerebro de un grupo de ratas normales recién nacidas, así como de placentas de ratas normales de 17 días de gestación.

2.8.5.1. Evaluación de la calidad de la albúmina empleada.

La BSA se emplea en los estudios de ligamiento para minimizar la adsorción de los péptidos a la superficie de los tubos, saturar eventuales sitios de unión inespecífica de las

membranas y proteger los péptidos de una posible degradación.

Con esta prueba se pretendía averiguar si el empleo de BSAs de distinta calidad influye en el porcentaje de unión específica, ya que la presencia de impurezas en forma de péptidos insulínicos puede falsear los resultados. Para ello se elaboraron curvas de desplazamiento, tanto de IGF-l como de RiF-II, empleando, en ambos casos, dos tipos de BSA de la casa Sigma: “BSA fraction y” y “BSA RíA-grade”. Para IGF-I se utilizó una preparación de membranas de cerebro, y para IGF-II se utilizó una preparación de

membranas de hígado, ambas a la concentración de 0,1 mg proteína/ml.

Como muestra la figura 2.10., las curvas obtenidas empleando los dos tipos de BSA son superponibles, por lo que en lo sucesivo se utilizó la “BSA fraction y”, más económica, en todas las pruebas.

2.8.5.2. Temperatura y tiempo de incubación.

Se estudió la cinética de ligamiento de IGF-I a membranas de hígado (1,5 mg proteína/mi) y cerebro (0, 1 mg proteína/mí) a temperatura ambiente. En ambos casos (Fig.

2.1 1.A) el máximo de ligamiento específico se alcanza a las 4 horas de incubación, y se sitúa en tomo al 1,5% para el hígado y 0,9% para el cerebro.

Para RiF-U se hizo un estudio análogo en membranas de hígado (0,2 mg proteína/mí) a dos temperaturas de incubación, 4 oc y 20 0C (temperatura ambiente). Como muestra

la figura 2.ll.B, a 4 0C se alcanzó un máximo en torno al 15% de unión específica ya a

las 5 horas de incubación. A 20 0C se llegó a un máximo de unión específica a los 15 minutos de incubación, produciéndose a continuación un ligero descenso en el porcentaje de unión, que alcanzó el equilibrio en torno al 10% a las 2 horas de incubación.

La degradación del radioligando al final de estas pruebas se situó en todos los casos en torno al 8%.

A la vista de estos resultados hemos elegido para nuestros experimentos un tiempo de

incubación de 15 horas a 4 0C o de 4 horas a 20 0C.

2.8.5.3. Concentración de proteínas.

El ligamiento específico de IGF depende también de la concentración de proteínas de la preparación. A fin de elegir una concentración de proteínas adecuada para los experimentos de ligamiento hemos determinado el porcentaje de unión específica de ambos ligandos, IGF-l y II, a preparaciones de hígado, cerebro y placenta.

2.8.5.3.1. IGF-I.

Con la finalidad de determinar el ligamiento inespecífico empleamos en estas pruebas tanto IGE-] como insulina para comprobar si podía utilizarse esta última, asequible en grandes cantidades, en lugar de IGF-I.

La figura 2.12. muestra cómo el ligamiento específico de IGF-I aumenta progresivamente con la concentración de proteínas y alcanza un máximo en hígado (entre 5 y 6%) a 4 mg de proteína/ml y en cerebro (en tomo a 6%) a 1 mg de proteína/ml. Para nuestros experimentos hemos elegido las concentraciones de 1 mg de proteína/ml para hígado y 0,1 mg de proteína/ml para cerebro. No hay diferencias en la unión específica empleando para el máximo desplazamiento IGF-I (90 nM) o insulina (25 pM).

En placenta se obtuvo un máximo de ligamiento específico (aproximadamente 3,5%) con 1 mg proteína/ml. La concentración de proteína adecuada nos habría proporcionado una unión específica muy baja, inferior al 2%, por lo que hemos excluido de nuestro estudio el ligamiento de IGF-I a placenta.

2.8.5.3.2. IGF-II.

Como se muestra en la figura 2.12., tanto en hígado como en placenta se obtuvo un

máximo de unión específica, en torno al 20 %, con una concentración de proteínas de 1

mg/ml. En cerebro el máximo se alcanzó en torno al 7% con 0,25 mg/ml.

Las concentraciones de proteínas que hemos elegido para los experimentos son 0,2 mg/ml para hígado y 0,1 mg/ml para cerebro y placenta.