Determinación de los parámetros leucocitarios

emigrados fueron determinados posteriormente mediante análisis de las imágenes grabadas en las cintas de video. Se define un leucocito en fase de rodamiento cuando su velocidad es inferior a la de los eritrocitos en el torrente circulatorio. El flujo de leucocitos en fase de rodamiento se calcula determinando el número de leucocitos que cruzan un punto de referencia del vaso durante un minuto. El mismo punto de referencia se debe utilizar a lo largo del experimento ya que los leucocitos pueden rodar en una sola sección del vaso antes de volver al torrente sanguíneo o pasar a convertirse en leucocitos adheridos. La velocidad de rodamiento (Vwbc) se determinó calculando el tiempo requerido por un leucocito en fase de rodamiento para recorrer 100 m de microvaso y es expresada en m/s. Un leucocito se define como adherido al endotelio vascular si permanece estacionado durante 30 segundos o más. La adhesión leucocitaria se expresa como el número de leucocitos adheridos por 100 m de vaso. La migración

leucocitaria se expresa como el número de glóbulos blancos emigrados por campo visual rodeando el vaso en estudio. Las respuestas leucocitarias se midieron en 3-5 arteriolas o vénulas diferentes seleccionadas al azar.

3.1.1.5. Estudio de las interacciones leucocito-endotelio inducidas por Ang-I, CMP48/80 y la combinación de ambos estímulos mediante el empleo de la microscopía intravital en el músculo cremáster de ratón.

Protocolos experimentales

En un primer estudio, con el fin de conocer los efectos, establecer la dosis y el tiempo óptimo para evaluar el efecto de Ang-I, se llevaron a cabo una serie de ensayos preliminares determinando las interacciones leucocito-endotelio inducidas por este decapéptido a distintos tiempos y dosis. Igualmente, a otro grupo de animales se administró Ang-II para evaluar su efecto en este protocolo. En un tercer grupo se evaluó las consecuencias de la degranulación mastocitaria mediante administración del compuesto 48/80 (CMP48/80). Tanto la Ang-I, como la Ang-II y el CMP 48/80 se administraron localmente mediante inyección intraescrotal en un volumen de 100 μl. Las medidas se efectuaron a la hora, a las 4 y a las 24 horas en los siguientes grupos experimentales tras recibir los distintos tratamientos. A. Tampón B. Ang-II (100 nM). C. Ang-I (1 nM). D. Ang-I (10 nM). E. Ang-I (100 nM). F. CMP48/80 (1 μg/ml).

Transcurrido el tiempo establecido, los animales fueron sometidos a la cirugía correspondiente, el cremáster fue expuesto para su visualización y tras 30 minutos de estabilización se procedió a la medida del flujo de leucocitos en fase de rodamiento, velocidad de rodamiento, número de leucocitos adheridos, número de leucocitos emigrados, Vrbc (velocidad de eritrocitos), diámetro y fuerza de cizallamiento a nivel venular. En las arteriolas se determinó el número de leucocitos adheridos, Vrbc (velocidad de eritrocitos), diámetro vascular y fuerza de cizallamiento. Previamente se demostró que la dosis de CMP48/80 utilizada en nuestros estudios causó interacciones leucocito-endotelio en un modelo similar de microscopía intravital (Gaboury et al., 1995).

Nuestros resultados preliminares demostraron que la exposición a Ang-II, Ang-I o CMP48/80 durante 4 y 24 horas causaban claras interacciones leucocito-endotelio en arteriolas, si bien a la hora se detectaron ya en vénulas post-capilares. Se consideró que la dosis de 100 nM Ang-I mostraba un efecto similar a Ang-II cuando ésta era ensayada a una dosis de 100 nM, igualmente se consideró escoger el tiempo de 4 h para la realización del resto de estudios adicionales.

Basándonos en estos resultados (Ang-I 100 nM, 4 h), se llevó a cabo un segundo estudio en el cuál se intentó establecer el papel de la ECA y la quimasa mastocitaria en las interacciones leucocito-endotelio inducidas por Ang-I. Un primer grupo de animales fue pretratado con un antagonista selectivo del receptor AT1 de Ang-II, el losartán (10 mg/kg, i.p.). Un segundo grupo fue pretratado con un inhibidor de la ECA, el enalapril (30 mg/kg, p.o.), 1 hora antes de la inyección intraescrotal de Ang-I 100 nM. Finalmente, el tercer grupo de animales fue pretratado con un inhibidor de la quimasa, la quimostatina (10 mg/kg, i.p.). Tanto el losartán como la quimostatina fueron administrados 30 minutos antes de la inyección intraescrotal de Ang-I 100 nM. Las respuestas leucocitarias de cada grupo

se evaluaron 4 horas después de la administración del estímulo. Los grupos experimentales fueron los siguientes:

A. Tampón.

B. Ang-I (100 nM).

C. Ang-I (100 nM) + Losartán (10 mg/kg). D. Ang-I (100 nM) + Enalapril (30 mg/kg). E. Ang-I (100 nM) + Quimostatina (10 mg/kg).

Estas dosis de losartán, enalapril y quimostatina ya se habían probado anteriormente en estudios in vivo y se había observado que inhibían las respuestas leucocitarias inducidas por Ang-II, y la actividad de la ECA y de la quimasa respectivamente (Álvarez et al., 2004; Goto et al., 2000; Chatterjee et al 2001).

Con el fin de dilucidar el posible papel de la quimasa mastocitaria, en otra serie de experimentos se administró CMP48/80 1µg/ml. Un grupo de animales fue pretratado con losartán (10 mg/kg, i.p.). Otro grupo de animales fue pretratado con enalapril (30 mg/kg, p.o.), 1 h antes de la administración intraescrotal de CMP48/80 1 µg/ml. Un tercer grupo fue pretratado con quimostatina (10 mg/kg, i.p.) y a un último grupo se le administró mepiramina (3 mg/kg), un antagonista de los receptores H1 de histamina, 30 minutos antes de la administración intraescrotal del CMP48/80 (1 g/ml). Al igual que en el protocolo anterior tanto losartán como quimostatina se administraron 30 minutos antes que el CMP48/80 1 µg/ml. En este caso se establecieron los siguientes grupos experimentales:

A. Tampón B. CMP48/80 (1 μg/ml). C. CMP48/80 (1 μg/ml) + Losartán (10 mg/kg). D. CMP48/80 (1 μg/ml) + Enalapril (30 mg/kg). E. CMP48/80 (1 μg/ml) + Quimostatina (10 mg/kg). F. CMP48/80 (1 μg/ml) + Mepiramina (3 mg/kg).

Ya que las respuestas leucocitarias inducidas por el CMP48/80 no se vieron completamente afectadas por ningún tratamiento (losartán, enalapril, quimostatina o mepiramina) en la microcirculación del cremáster de ratón, a excepción de la velocidad de rodamiento, a otro grupo de animales se les administró intraescrotalmente la combinación de ambos estímulos, Ang-I (100 nM) y CMP48/80 (1 g/ml), para observar las respuestas obtenidas y compararlas con aquellas que se producían cuando cada estímulo se administraba por separado. En estos experimentos, los animales fueron pretratados con losartán, enalapril, quimostatina, o con una combinación de ambos inhibidores enzimáticos 30 o 60 minutos antes de la coadministración vía intraescrotal de ambos estímulos. Los grupos experimentales fueron los siguientes:

A. Tampón.

B. Ang-I 100 nM C. CMP48/80 (1 μg/ml)

Siguiente protocolo: A. Tampón. B. Ang-I 100 nM + CMP48/80 (1 μg/ml) C. Ang-I 100 nM + CMP48/80 (1 μg/ml) + Losartán (10 mg/kg). D.Ang-I 100 nM + CMP48/80 (1 μg/ml) + Enalapril (30 mg/kg). E. Ang-I 100 nM + CMP48/80 (1 μg/ml) + Quimostatina (10 mg/kg). F. Ang-I 100 nM + CMP48/80 (1 μg/ml) + Enalapril (30 mg/kg) + Quimostatina (10 mg/kg).

En otro grupo de experimentos, los animales se pretrataron con cromolín, un agente estabilizador de mastocitos. Se administró a una dosis de 100 mg/kg, i.p. 30 min antes y 3,5 h después de la administración intraescrotal del estímulo. Además, también se añadió esta sustancia al tampón de superfusión a una concentración de 0,33 mg/ml según se había descrito previamente (Gaboury et al., 1995). Los grupos experimentales fueron:

A. Tampón.

B. Ang-I 100 nM +CMP48/80 (1 μg/ml).

C. Ang-I 100 nM +CMP48/80 (1 μg/ml) + Cromolín (100 mg/kg).

Para confirmar que efectivamente la quimasa mastocitaria estaba generando Ang-II a partir de Ang-I, se administró salino o la combinación de Ang-I + CMP48/80 a ratones deficientes en mastocitos WBB6F1/J- Kitw/Kitw-v y se evaluaron las respuestas 4 horas después de la

administración del estímulo. Además un grupo de estos ratones KO en mastocitos también fue pretratado con cromolín antes de la administración intraescrotal del estímulo. Los grupos experimentales fueron:

A. Tampón. B. Ang-I 100 nM C. CMP48/80 (1 μg/ml). D. Ang-I 100 nM +CMP48/80 (1 μg/ml). E. Ang-I 100 nM +CMP48/80 (1 μg/ml) + Cromolín (100 mg/kg).

3.1.1.6. Estudio de las interacciones leucocito- endotelio inducidas por humo de tabaco en ratones salvajes (CX3CR1+/+) y ratones deficientes en el receptor de FRK

(CX3CR1-/-) mediante el empleo de la microscopía

intravital en la microcirculación cremastérica del ratón.

Protocolo experimental

El protocolo experimental será semejante al descrito por Doz y col. (2008). Los animales (C57BL/6J o deficientes en el receptor de FRK (CX3CR1), se colocaron en una cámara de plexiglás de 19 cm3. El humo producido por la combustión del cigarrillo se introducía en la cámara donde estaban los ratones a un flujo de 25 ml/min. Por tanto, los ratones fueron expuestos al aire o al humo de 10 cigarrillos diarios (Cigarrillos normalizados, Universidad de Kentucky con filtro; 3R4F cigarrillos de investigación: 15 mg de alquitrán y 1,16 mg de nicotina) en dos sesiones de 30 minutos separadas por un espacio de 30-60 minutos.

Grupos experimentales

Con el fin de investigar el efecto del humo de tabaco sobre las interacciones leucocito-endotelio en la microcirculación cremastérica de ratones salvajes (CX3CR1+/+) y ratones deficientes en el receptor de FRK (CX3CR1-/-), se estudiaron los siguientes grupos experimentales:

A. Ratones salvajes (CX3CR1+/+) B. Ratones CX3CR1-/-

Ambos grupos experimentales se expusieron bien a aire o a humo de tabaco durante 3 días y las respuestas se evaluaron 16 horas después de la última exposición. Transcurrido el tiempo establecido, los animales fueron sometidos a la cirugía correspondiente, el cremáster fue expuesto para su visualización y tras 30 minutos de estabilización se procedió a la medida del flujo de leucocitos en fase de rodamiento, velocidad de rodamiento, número de leucocitos adheridos, número de leucocitos emigrados, Vrbc (velocidad de eritrocitos), diámetro y fuerza de cizallamiento a nivel venular. En las arteriolas se determinó el número de leucocitos adheridos, Vrbc (velocidad de eritrocitos), diámetro vascular y fuerza de cizallamiento.

Una vez finalizada la microscopía intravital, de algunos ratones se obtuvo el LBA (lavado broncoalveolar) y de otros se guardaron los pulmones en formol para realizar el estudio inmunohistoquímico.

3.1.2. Estudio y cuantificación de la desgranulación mastocitaria