Determinación de proteínas 1 Método: Kjedahl.

3.12.2.Fundamento:

Este método se basa en la descomposición de los compuestos de nitrógeno orgánico por ebullición con ácido sulfúrico. El hidrógeno y el carbón de la materia orgánica se oxidan para formar agua y bióxido de carbono. El ácido sulfúrico se transforma en SO2, el cual reduce el material nitrogenado a sulfato de amonio. El

amoniaco se libera después de la adición de hidróxido de sodio y se destila recibiéndose en una disolución al 2% de ácido bórico. Se titula el nitrógeno amoniacal con una disolución valorada de ácido, cuya normalidad depende de la cantidad de nitrógeno que contenga la muestra. En este método de Kjeldahl-Gunning se usa el sulfato de cobre como catalizador y el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la digestión. La determinación de proteínas se realizó empleando la metodología Kjedahl, el cual determina el porcentaje de nitrógeno total que multiplicado por un factor,

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proporciona la cantidad de proteína en una muestra. Para este cálculo se empleó el siguiente modelo matemático.84

% 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 𝑉 𝑥 𝑁 𝑥 0.014 𝑥 100 𝑚

V = Volumen de ácido clorhídrico empleado en la titulación, en mL. N = Normalidad del ácido clorhídrico.

m = peso de la muestra en gramos. 0.014 = Miliequivalente del nitrógeno.

Para realizar el cálculo del contenido proteico final como porcentaje en masa se emplea la siguiente formula:

% Ptotal = % Ntotal x 6.25

3.12.3.Procedimiento:

Pesar 1.000 g de la muestra en un matraz Kjeldahl, añadirle 2 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25 mL de ácido sulfúrico y unas perlas de vidrio. Seguidamente colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja temperatura hasta que todo el material esté carbonizado, aumentar gradualmente la temperatura hasta que la disolución esté completamente clara y dejar por 30 minutos más a esa temperatura. Posteriormente enfriar y añadir de 400 a 450 mL de agua para disolver completamente la muestra, agregar 3 ó 4 gránulos de zinc y 50 mL de hidróxido de sodio 1:1. Inmediatamente conectar el matraz a un sistema de destilación, el cual previamente se le ha colocado en la salida del refrigerante un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 50 mL de ácido bórico y unas gotas del reactivo Shiro-Tashiro como indicador. Inmediatamente destilar hasta que haya pasado todo el amoniaco (que unas gotas de destilado no den alcalinidad con el papel tornasol, aproximadamente 300 mL). Finalmente retirar el matraz recibidor y titular el destilado con ácido clorhídrico 0.1 N.

71 3.13.Determinación de lípidos

3.13.1.Método: Soxhlet 3.13.2.Fundamento:

Es una extracción semicontinua con un disolvente orgánico. En este método el disolvente se calienta, se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el disolvente. Posteriormente éste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso. La determinación de grasas totales fue determinada bajo el protocolo correspondiente a la regulación ISO 1443 el cual expresa los resultados en un valor porcentual de peso, para su determinación se emplea el siguiente modelo matemático.84

𝑷𝒐𝒓𝒄𝒆𝒏𝒕𝒂𝒋𝒆 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 = 𝑷𝟏 − 𝑷

𝑷𝟐 𝑿 𝟏𝟎𝟎

P= Peso en g del matraz.

P1 = Peso en g del matraz con la grasa. P2 = peso en g de la muestra.

3.13.3.Procedimiento:

Inicialmente se realizará la determinación de la humedad de las muestras, ya que los lípidos no pueden ser extraídos con efectividad de los alimentos húmedos, por lo que procedemos a pesar una placa petri limpia y seca, enseguida se procederá a triturar la muestra y pesar aproximadamente 10 g en la placa. Seguidamente colocar la muestra en la estufa a 105 °C por 12 h. Para luego dejar enfriar la placa que contiene la muestra en un desecador y pesar nuevamente cuidando de que el material no este expuesto al medio ambiente. Posteriormente sacar del horno el balón de extracción, enfriar en un desecador y pesar el balón, también pesar la muestra en papel filtro, colocar la muestra en la unidad de extracción, conectar el extractor al matraz con éter de petróleo a 2/3 del volumen total enseguida llevar a ebullición y ajustar el calentamiento. Al término, colocar el balón en el horno durante hora y media para eliminar el éter y enfriar el balón en un desecador y pesar.

72 3.14.Métodos estadísticos

La presente investigación se realizó por triplicado (n=3), consiguiendo tres valores para la determinación de la concentración de Astaxantina, proteínas y lípidos en músculos de la trucha. Se determinó el valor promedio, la desviación estándar, coeficiente de variación. Frente a los resultados obtenidos se usaron parámetros de distribución central, de dispersión como son la desviación estándar (S) y desviación estándar relativa (RSD) además se realizó el análisis de varianza (ANOVA) y el test de Tukey.43 Para poder ver el cálculo de los parámetros estadísticos se realizó en el programa Microsoft Excel.

3.14.1.ANOVA (Análisis de varianza)

Este es una prueba de significancia, la cual tiene como objetivo demostrar estadísticamente si el efecto hallado al aplicar los tratamientos es debido a los mismos o a causas fuera de los tratamientos.43

F de V SC GL CM FC Entre grupos Dentro de grupos Total F de V : Fuente de variabilidad GL : Grados de Libertad. SM : Suma de cuadrados. CM : Cuadrado medio. FC : Prueba F.

3.14.2.Prueba de especificidad: Test de Tukey

Se aplica una vez obtenidos los resultados del análisis de varianza ANOVA, es decir si en el análisis de varianza los resultados obtenidos fueran significativos a los diferentes tratamientos, se procederá a averiguar estadísticamente cuál de ellos fue más eficiente o más específico, de no hallarse significancia en la prueba de ANOVA no será necesario realizar el test de Tukey.43

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CAPÍTULO III