Determinación del Número Más Probable e Identificación de

Termotolerantes y Escherichia coli

2.1.5.2.1. Determinación de Coliformes Totales.

Prueba presuntiva:

Consiste en la inoculación de una cantidad determinada de la muestra en tubos de fermentación que contienen un medio de cultivo apropiado, examinando al cabo de determinado tiempo de incubación las reacciones provocadas por los organismos coliformes. Este examen es denominado presuntivo, a causa de que las reacciones observadas, pueden ser provocadas por otros organismos no coliformes, por lo que la presunción de que la reacción es debido a organismos coliformes debe ser confirmada (8).

Se utilizó Caldo Lauril Sulfato en volúmenes de 9 ml de concentración simple (X) para inóculos de 1 ml de muestra. El frasco de la muestra fue agitado con movimientos constantes para mayor homogenización, luego se tomó 1ml de la muestra utilizando una pipeta esterilizada y se transfirió a un tubo de

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ensayo que contenía 9 ml del agua tamponada de dilución, de esta forma se obtuvo una dilución al décimo de la muestra (10- 1_{) que también debe homogenizarse, con otra pipeta estéril se} retiró 1 ml de la primera dilución y se pasó a otro tubo con agua de dilución con lo que la muestra original es diluida al centésimo (10-2_{) y así sucesivamente hasta llegar a la dilución conveniente} (10-n_{) .}

En grupos de 5 tubos se pipeteo 1 ml de la muestra hacia los tubos que contenían Caldo Lauril Sulfato de simple concentración, cada tubo con su respectiva campana de Durham. Empleando la dilución (10-1_{) como muestra, con ayuda} de una nueva pipeta estéril se retiró 1 ml y se transfirió a cinco tubos que contienen Caldo Lauril Sulfato de simple concentración; se continuó la serie con la siguiente dilución (10- 2_{), también en tubos de fermentación de Caldo Lauril Sulfato de} simple concentración. La serie continuó hasta que la dilución final rinda resultados negativos (ver Anexo Nº 1).

Luego de inoculada la muestra, los tubos de ensayo fueron llevados a la incubadora a 37°C por 24 — 48 horas. Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos fueron examinados, si no se producía acido/gas, se vuelve a examinar a las 48 horas. Los tubos que resultaron positivos se observó la producción de gas, esto como resultado de la fermentación se enturbia el caldo y al agitarlo suavemente y con movimientos de rotación se observa la aparición continua de pequeñas burbujas de gas en el medio; se seleccionaron los tubos posivos para la prueba confirmativa y se procedió con la siguiente etapa.

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Prueba Confirmativa.

Consiste en la confirmación de la presencia de organismos coliformes y Escherichia coli que al crecer sobre medios selectivos eliminan los resultados de la prueba presuntiva, y se realiza mediante subcultivo de cada tubo positivo en medios de confirmación líquidos o sólidos.

Para esta prueba se utilizaron tubos con Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis (Brila) cada uno con una campana de Durham invertido; y a partir de los tubos positivos de Caldo Lauril Sulfato (los tubos que presentan formación de gas y acidez), se tomó con el asa de siembra dos asadas y se inoculó en Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis, terminada la siembra se incubó a 37°C por 24 – 48 horas para determinar la presencia de bacterias coliformes totales, luego del periodo de incubación, la prueba fue considerada positiva si presentaba la producción de gas y acidez. (Ver Anexo N°. 1)

2.1.5.2.2. Determinación de Coliformes fecales o Termotolerantes

Para determinar la presencia de Coliformes fecales o Termotolerantes se usó tubos de fermentación con Caldo EC, en cuyo interior de cada tubo de ensayo se colocó una campana de Durham invertida (28).

A partir de los tubos que presentaron gas y acidez del Caldo Lauril Sulfato (Prueba Presuntiva) se tomaron dos azadas con el asa bacteriológica y se les inoculó en los tubos de fermentación que contenían Caldo EC. Luego se pasó a incubarlos a 44.5°C por 24 horas en Baño María; pasadas las 24 horas se retiraron los tubos del Baño María y se observó, la producción de gas y turbidez.

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Cálculo del Número Más Probable (NMP)

El método del NMP (Número Más Probable) proporciona una estima de los organismos viables existentes en un sustrato. Es un concepto estadístico derivado de la teoría de probabilidades aplicable a la enumeración de microorganismos bajo ciertas condiciones (17, 38)

Se calculó el NMP basándose en las combinaciones de tubos positivos y negativos en cada dilución, reportando los resultados de Coliformes Totales y Fecales. La densidad de las bacterias coliformes se expresó como NMP de Coliformes Totales por 100 ml y NMP de Coliformes Fecales por 100 ml. El NMP se obtuvo a través de tablas. (Ver Anexo N°.2) en las que se presentan el límite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado.

Valor de la Tabla NMP x 10 = NMP/100ml (Volumen de la Dilución inicial)

2.1.5.2.3. Determinación de Escherichia Coli.

Prueba Presuntiva.

Para la determinación de E. coli se tomaron 10 g de la muestra de queso fresco artesanal, se colocó en un frasco con 90 ml de medio Agua Peptonada (AP), luego con una pipeta estéril se tomó 1ml del frasco con la muestra y se transfirió a un tubo de ensayo con 9ml medio AP (agua peptonada), de modo que se obtuvo una dilución al centésimo de la muestra (10-2_{); con otra} pipeta estéril se volvió a tomar de la primera dilución y se pasó a otro tubo con agua de dilución con lo que la muestra original es diluida al milésimo (10-3_{) y así hasta obtener una dilución} deseada (10-n_).

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En grupos de 5 tubos se pipeteo 1 ml de la muestra hacia los tubos que contenían Caldo Lauril Sulfato de simple concentración, cada tubo con su respectiva campana de Durham. Empleando la dilución (10-1_{) como muestra, con ayuda} de una nueva pipeta estéril se retiró 1 ml y se transfirió a cinco tubos que contienen Caldo Lauril Sulfato de simple concentración; se continuó la serie con la siguiente dilución (10- 2_{), también en tubos de fermentación de Caldo Lauril Sulfato de} simple concentración. La serie continuó hasta que la dilución final rinda resultados negativos (ver Anexo Nº 3).

Luego de inoculada la muestra en los tubos de ensayo se pasó a incubarlos a 37°C por 24 horas. Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos fueron examinados, si no se produjo gas se les volvió a examinar a las 48 horas. Los tubos que resultaron positivos (presencia de gas y turbidez) se seleccionaron para realizar la prueba confirmativa y se procedió con la siguiente etapa.

Prueba Confirmativa.

Para esta prueba los tubos positivos de la anterior prueba, se inoculó con ayuda de un asa de siembra dos asadas al Caldo EC (10 ml), y se les pasó a incubar en baño María a 45o_{C por} 24h a 48h ± 2h, luego nuevamente con el asa de siembra se tomaron dos asadas de los tubos positivos del caldo EC (presencia de gas y turbidez) hacia los tubos con Caldo o Agua

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Peptonada (5 ml por tubo), procedió a incubarlos a baño María a 45°C por 48 horas, pasado este periodo se añadió 0,5 ml de reactivo de Kovac’s en cada tubo, se observó, luego de un minuto se hizo lectura de cada tubo por dilución, contando el número de tubos que formaron un anillo rojo (tubos positivos), que indica la presencia de Escherichia coli, luego se observó en la tabla de NMP para alimentos (Ver Anexo Nº. 2).

Cálculo del Número más Probable (NMP)

Se calculó el NMP basándose en las combinaciones de tubos positivos y negativos en cada dilución, reportando de esta forma los resultados de Escherichia coli mediante la formación del anillo rojo (tubos positivos) presencia de indol. La densidad de bacterias se expresó como NMP por gramo. El NMP se obtuvo a través de tablas (ver Anexo .Nº 2) en las que se presentan el límite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado.

Valor de la Tabla NMP = NMP/g (Volumen de la Dilución inicial)

2.1.5.3. Determinación de las Unidades Formadoras de Colonias e