CCIBP-C5 Control
4.2 Determinación del efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de
plantas de Musa spp. inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo
RESULTADOS
En presencia de los filtrados bacterianos aplicados tres días antes (A) o tres días después (D) de la inoculación con Mycosphaerella fijiensis se observaron síntomas típicos de la enfermedad en casa de cultivo según lo descrito previamente por Alvarado-Capó et al. (2003). Sin embargo, se comprobó que la aplicación de estos, tuvieron efecto sobre la respuesta de plantas inoculadas con M. fijiensis.
El efecto de los diferentes filtrados de cultivo sobre la respuesta de plantas de Musa inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo a los 70 dpi con respecto al control dependió de las cepas evaluadas así como del momento de su aplicación (Figura 7).
Resultados y Discusión
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Figura 7. Efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de plantas de ‘Grande naine’ inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo a los 70 dpi. a) Control, b) CCIBP-M27 A, c) CCIBP-M27 D, d) CCIBP-B3 A, e) CCIBP-B3 D, f) CCIBP-A4 A, g) CCIBP-A4 D, h) CCIBP-C5 A e i) CCIBP-C5 D
a
b
c
d
e
g
f
Resultados y Discusión
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En las plantas del tratamiento control a los 70 dpi las lesiones coalescieron y las hojas se observaron completamente necrosadas. Similar efecto fue observado en las plantas en presencia de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-A4 (en ambos momentos de inoculación) y CCIBP-B3 (aplicado tres días después de la inoculación con M. fijiensis). Sin embargo, las plantas en presencia de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 en ambos momentos de inoculación y en la cepa CCIBP-B3 cuando fue aplicado tres días antes de la inoculación con M. fijiensis se observó tejido verde. En el caso de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 las lesiones se observaron de forma aislada y nunca coalescieron.
El período de incubación para todas las plantas fue de 15 días. Las demás variables epifitiológicas propuestas por Leiva-Mora et al. (2010), para los diferentes tratamientos variaron respecto al control (Tabla 2).
Tabla 2. Variables epifitiológicas evaluadas en plantas de Musa inoculadas con M. fijiensis y filtrados de cultivo bacterianos, en casa de cultivo
Tratamientos Tiempo de evolución de los síntomas (TES) (días)
Tiempo de desarrollo de la enfermedad (TDE) (días) Control 27 42 CCIBP-M27A 55 70 CCIBP-M27D M27D 48 63 CCIBP-B3 A 48 63 CCIBP-B3 D 48 63 CCIBP-A4 A 34 49 CCIBP-A4 D 27 42 CCIBP-C5 A 48 63 CCIBP-C5 D 55 70
Resultados y Discusión
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En todos los casos el patógeno completó el ciclo la enfermedad, ya que se observaron lesiones necróticas con centro seco en el período evaluado. Sin embargo, las plantas que fueron inoculadas con los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27A y CCIBP-C5 D no alcanzaron el estado de síntomas 5 (Hoja con manchas negras con centros secos grises, las hojas pueden estar completamente necrosadas y colgar del pseudotallo, según escala cualitativa propuesta por Alvarado-Capó et al., 2003) y se retardó en 28 días la aparición de lesiones necróticas con centro seco respecto al control. Para el resto de los tratamientos el TES se retrasó por 21 días, excepto para el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4. Este aplicado antes de la inoculación de M. fijiensis se retardó una semana, mientras que aplicado después no difirió con el control.
Cuando se determinó el área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), se observó que los valores difirieron en una misma cepa en dependencia del momento de aplicación del filtrado de cultivo, excepto para la cepa CCIBP-A4 y CCIBP-B3 (Figura 8). Con los filtrados de la cepa CCIBP-A4 se produjeron las mayores áreas bajo la curva del progreso de la enfermedad, difiriendo significativamente del resto de los tratamientos. Es de destacar que los valores más bajos se observaron en los tratamientos donde se aplicaron los filtrados de las cepas CCIBP-M27antes y CCIBP-C5 después de la inoculación de M. fijiensis y que difirieron significativamente del control.
Resultados y Discusión
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Figura 8. Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) para los diferentes tratamientos aplicados en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo (Medias con letras desiguales difieren según prueba de Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
En cuanto a la evaluación de los componentes de la resistencia, se observaron diferencias significativas respecto al número y el área de las lesiones necróticas en plantas de Musa spp. inoculadas con M.fijiensis al ser tratadas con filtrados de cultivo bacterianos.
En este caso también el efecto de los filtrados de cultivo se vio influenciado por el momento de su aplicación. Fue encontrada una reducción significativa del número de lesiones necróticas a los 49 dpi para todos los tratamientos con relación al control a excepción del tratamiento con el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4 aplicado tres días después (Figura 9). Este último fue 59% superior al control. El menor número de lesiones necróticas se observó en los tratamientos con filtrado de cultivo de las cepas CCIBP-M27 A y CCIBP-C5 D, siendo 88 y 86% respectivamente menor respecto al control.
Resultados y Discusión
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Figura 9. Número de lesiones necróticas por hojas en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas con M.
fijiensis en casa de cultivo a los 49 dpi y con filtrados de cultivos bacterianos de cepas con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Aunque el número de lesiones necróticas por hoja inoculada disminuyó en las que se aplicaron filtrados de cultivo bacterianos, excepto el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4 aplicado después de la inoculación con M. fijiensis, su área se mantuvo igual o se incrementó significativamente excepto para el tratamiento con el filtrado de cultivo de CCIBP- C5 aplicado antes de la inoculación con el patógeno (figura 10).
Resultados y Discusión
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Figura 10. Área de las lesiones necróticas ocasionados por M. fijiensis en hojas de plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA) inoculadas con diferentes filtrados de cultivo bacterianos en casa de cultivo a los 49 días después de la inoculación (dpi) (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
En la tabla 3 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para cada una de las variables evaluadas en la determinación del efecto de los filtrados de cultivo de las cepas bacterianas sobre la respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo. a d ab a b b c c
Resultados y Discusión
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Tabla 3. Resumen de las variables epifitiológicas y del componente de la resistencia para las plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA). inoculadas con M. fijiensis y filtrados de cultivo de cepas bacterianas respecto al control (planta inoculada con M. fijiensis)
Variables CCIBP-M27 CCIBP-B3 CCIBP-A4 CCIBP-C5
Antes Después Antes Después Antes Después Antes Después
TES ++ + + + + = + ++ TDE ++ + + + + = + ++ ABCPE + = = = = = = + Número de lesiones necróticas ++ + + + + - + ++
Área de las lesiones necróticas
- - - - + = + =
Respuesta relativa con respecto al control. Positiva (+), negativa (-), igual (=)
DISCUSIÓN
Los filtrados de cultivo bacterianos influyeron en la respuesta de las plantas inoculadas con
M. fijiensis y dependió de la cepa y del momento de su aplicación, posiblemente por los
mecanismos de acción sobre el patógeno (inhibición del crecimiento) o la planta (inducción de resistencia). De esta manera se constató que las cepas con actividad antifúngica in vitro también mostraron actividad in vivo. Es de destacar que los filtrados de cultivo bacterianos aplicados no contenían preservantes, conservantes ni estabilizantes que los protegieran de la acción de la luz, el sol, el agua de riego, entre otros factores ambientales a los que estuvieron expuestos. En tal sentido, Chan et al. (2003) plantearon que la selección in vivo
Resultados y Discusión
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permite observar la actividad del potencial biocontrolador en un medio similar al que se desenvolverá en el campo.
Las variables epifitiológicas evaluadas, para el tratamiento con el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4 no mostraron diferencias significativas respecto al control. Esto pudo estar dado por la pérdida de la actividad antifúngica en casa de cultivo, a pesar de presentar actividad antifúngica in vitro. Este comportamiento no se observó para ninguna de las otras bacterias en estudio. Según Chan et al. (2003) los ensayos de difusión en agar son un método de selección para microorganismos antagonistas, ya que es práctico para probar un amplio número de aislados respecto a los ensayos en plantas. Sin embargo los ensayos en planta son esenciales para verificar la efectividad del potencial candidato, ya que la actividad
in vitro puede no estar correspondida con el biocontrol in vivo. Esto puede estar relacionado
con la exposición de los compuestos antimicrobianos a factores bióticos como la temperatura, el agua, la luz, entre otros.
El hecho de que las plantas tratadas con el filtrado de cultivo bacteriano de las cepas CCIBP- M27 aplicado antes y CCIBP-C5 aplicado después de la inoculación con el patógeno, no alcanzaron el estado de síntomas 5, pudo ser debido al mecanismo de inducción de la resistencia. El análisis del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) indicó que con excepción de los filtrados de cultivo bacterianos de las cepas CCIBP-M27 aplicado antes y CCIBP-C5 aplicado después de la inoculación con el patógeno, el resto no mostró diferencias significativas respecto al control. Estos resultados expresan la importancia del ABCPE, para poder determinar el incremento temporal de la progresión de la enfermedad en plantas de Musa inoculadas artificialmente con M. fijiensis en casa de cultivo y así poder diferenciarlas ante diferentes tratamientos antifúngicos.
En este estudio se implementó por vez primera el ABCPE para evaluar cuantitativamente la respuesta de plantas de Musa inoculadas artificialmente en casa de cultivo con M. fijiensis y
Resultados y Discusión
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sometidas a diferentes tratamientos con filtrados de cultivo bacterianos, con actividad antifúngica in vitro. Esta variable ha sido empleada con otros fines, por ejemplo, Jeger y Viljanen-Rollinson (2001), mostraron el uso del ABCPE para evaluar la resistencia a enfermedades causadas por varios patógenos fúngicos en diferentes cultivos económicos. Estos autores concluyeron que esta variable es útil para determinar la resistencia cuantitativa frente a diversas enfermedades en evaluaciones sucesivas. Comúnmente, el ABCPE se utiliza para determinar la efectividad de fungicidas en el control de enfermedades foliares en condiciones de campo, causadas por especies del género Mycosphaerella (Young et al., 2006; Burke y Dunne, 2008), así como en la evaluación de la resistencia a enfermedades fúngicas (Phillips et al., 2005; Eshraghi et al., 2007) y Leiva-Mora et al. (2010) la utilizó para diferenciar genotipos en cuanto a la resistencia a este patógeno en casa de cultivo.
A los 70 días después de la inoculación con el patógeno, las plantas tratadas con los filtrados de cultivo bacterianos de las cepas CCIBP-M27 (aplicado antes) y CCIBP-C5 (aplicado después de la inoculación con el patógeno) y en menor grado el filtrado de cultivo bacteriano de CCIBP-B3 (aplicado antes de la inoculación con el patógeno) mostraron tejido verde fotosintético, lo que no sucedió con el resto de los filtrados de cultivo bacterianos. En estos casos, fue evidente el potencial de estos filtrados de cultivo como control biológico de M.
fijiensis en casas de cultivo. Es probable, para estos casos, que los compuestos que se
liberan al medio de cultivo tengan acción inhibitoria directamente sobre el patógeno, como se observó en los experimentos in vitro, pero además sean inductores de la resistencia al ser inoculados sobre plantas.
Atendiendo a los resultados en la evaluación de los componentes de la resistencia, el menor número de lesiones necróticas a los 49 dpi observado en las plantas inoculadas con el filtrado de cultivo de CCIBP-M27 (aplicado antes) y CCIBP-C5 D (aplicado después) estuvo en correspondencia con los resultados en las variables epifitiológicas, debido quizás a la
Resultados y Discusión
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inducción de resistencia sistémica. En los tratamientos, el área de las lesiones necróticas a los 49 dpi mayores respecto al control, pueden estar dadas por una respuesta de hipersensibilidad en la planta. Al comparar este resultado con los obtenidos para el número de lesiones necróticas, se evidenció de forma general que los tratamientos presentaban un menor número de las lesiones pero con área mayor. Sin embargo, se requieren estudios posteriores para confirmar este resultado.
La inducción de resistencia sistémica en plantas ha sido objeto de estudio de varias investigaciones. Su aplicación es importante para combatir enfermedades difíciles de controlar. Autores como, Ferreira et al. (2007) hicieron un estudio del papel de las proteínas de defensa en las plantas en la patogénesis fúngica, donde se analizan cada una de las proteínas antifúngicas involucradas; entre las que se encuentran las glucanasas y quitinasas. Por otra parte, Pavlo et al. (2011) utilizaron bacterias endofíticas aisladas de la filosfera de la papa en la inducción de resistencia en este cultivo, a partir de la inoculación del esqueje de la planta con la suspensión bacteriana. En este caso el patógeno fue inoculado en la planta tres semanas después y se redujo su crecimiento en un 50%.
4.3 Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in
vitro frente a M. fijiensis
RESULTADOS
4.3.1 Estandarización del método para evaluar el crecimiento de M. fijiensis
Las curvas de crecimiento de M. fijiensis en medio de cultivo PDB, obtenidas a partir de los
valores de masa seca y absorbancia a DO595nm como medida del crecimiento del hongo, se
muestran en la figura 11. Se observó incremento en la masa del micelio y en la turbidez del medio de cultivo a medida que transcurrió el tiempo.
Resultados y Discusión
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a)
b)
Figura 11. Curvas de crecimiento de M. fijiensis en medio de cultivo líquido a) por medida de la absorbancia a 595 nm b) a partir de valores de masa seca (g).
Se encontró una relación lineal entre la Absorbancia a 595 nm del crecimiento de M. fijiensis en medio de cultivo respecto a la masa seca (g) (Figura 12). Existió una alta calidad de ajuste, ya que R2 en la regresión lineal entre absorbancia y masa seca fue de un valor de 0,9993, cercano a la unidad.
Resultados y Discusión
53
Figura 12. Regresión lineal entre Absorbancia DO595nm vs. Masa seca (g) de la curva de crecimiento de
M. fijiensis en medio de cultivo líquido
4.3.2 Determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Se logró determinar la estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos, atendiendo a variaciones de la temperatura y el pH, así como ante la presencia de detergentes y proteasas.
4.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Se determinó que los filtrados de cultivo (fc) obtenidos después de 48 h de incubación, para cada una de las cepas bacterianas en estudio excepto para CCIBP-M27, eran termoestables. Esta cepa fue la más afectada por el efecto de la temperatura y presentó una mayor
Resultados y Discusión
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actividad inhibitoria a 28ºC. La cepa CCIBP-A4 mostró una disminución de la actividad antifúngica a 121ºC (Figura 13)
a)
Resultados y Discusión
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c)
d)
Figura 13. Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacterianos en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) CCIBP-M27, b) CCIBP-B3, c) CCIBP-A4, d) CCIBP-C5 (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Resultados y Discusión
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En resumen, de los filtrados de cultivo en estudio, CCIBP-M27 fue el más afectado por la variación de la temperatura.
4.3.2.2 Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
Se determinó que la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo, de cada una de las cepas bacterianas en estudio, varió a diferentes valores de pH en dependencia de la cepa. A pH = 7 se vio afectado el crecimiento de M. fijiensis.
Al someter el filtrado de cultivo (fc) bacteriano de la cepa CCIBP-M27 durante 20 minutos a diferentes valores de pH, se afectó su actividad antifúngica excepto a pH=2 (Figura 14 a). En el caso del filtrado de cultivo bacteriano de la cepa CCIBP-B3 la actividad antifúngica se mantuvo solo a pH=6 (Figura 14 b). Para el filtrado de cultivo bacteriano de la cepa CCIBP- A4 hubo efecto inhibitorio para todos los pH evaluados, siendo los valores más altos de inhibición del crecimiento de M. fijiensis a pH=2 y 8 (Figura 14 c). En cuanto al filtrado de cultivo bacteriano de la cepa CCIBP-C5 la variación de pH no afectó la actividad antifúngica en todos los pH evaluados (Figura 14 d).
Resultados y Discusión
57
a)
Resultados y Discusión
58
c)
d)
Figura 14. Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacterianos en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) CCIBP-M27, b) CCIBP-B3, c) CCIBP-A4, d) CCIBP-C5 (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
En resumen, a pH ácido igual a dos mostraron actividad antifúngica todos los filtrados de cultivo, excepto el de la cepa CCIBP-B3 que solo tuvo actividad inhibitoria a pH=6. Sin
Resultados y Discusión
59
embargo, a pH básico igual a ocho solo mostraron actividad antifúngica los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5.
4.3.2.3 Efecto de detergentes sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo, de las cepas bacterianas en estudio, no se vio afectada ante la acción del detergente aniónico SDS (Figura 15 a). Sin embargo, las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 se afectaron ante la presencia del detergente catiónico CTAB (Figura 15 b). Por otra parte, el detergente no iónico Triton X-100 afectó la actividad inhibitoria de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 (Figura 15 c). Además, el detergente no iónico Tween-80 afectó la actividad inhibitoria del filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-C5. Es importante destacar que este detergente afectó el crecimiento de
M.fijiensis, mientras que para el resto de los detergentes el crecimiento del hongo se
mantuvo igual o menor respecto al control (Figura 15 d).
Es importante destacar que el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-B3 mantuvo su actividad inhibitoria al ser expuesto a la acción de todos los detergentes empleados en el estudio (SDS, CTAB, Triton X-100 y Tween-80).
Resultados y Discusión
60
a) b) a c b ab bc bResultados y Discusión
61
c)
d)
Figura 15. Efecto de los detergentes sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacteriano en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) SDS, b) CTAB, c) Triton X-100 y d) Tween-80 (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Resultados y Discusión
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En resumen, la actividad antifúngica no fue estable en ninguno de los filtrados de cultivo bacteriano en presencia del detergente aniónico. La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 se perdió ante la presencia del detergente catiónico. En el caso de los detergentes no iónicos, Triton afectó la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 y Tween-80 afectó la actividad antifúngica del filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-C5, pero también el crecimiento de M.
fijiensis.
4.3.2.4 Efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos en presencia de la proteinasa K (100µg/mL) se vio afectada, excepto para la cepa CCIBP-B3 (Figura 16).
Figura 16. Efecto de las proteasas (pK) sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacteriano frente a M.fijiensis en placas de 96 pocillos incubadas 48 horas, a 30oC y oscuridad (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Resultados y Discusión
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En la tabla 4 se muestra un resumen de los resultados en la determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de filtrados de cultivo de las cepas bacterianas expuestos a variaciones de la temperatura, el pH, la presencia de detergentes y proteasas.
Tabla 4. Estabilidad de la actividad antifúngica de filtrados de cultivo respecto al control de crecimiento de M. fijiensis
Factores CCIBP-M27 CCIBP-B3 CCIBP-A4 CCIBP-C5
Temperatura (ºC) -80 - + + + 4 - + + + 28 + + + + 60 - + + + 121 - + +/- + pH 2 + = + + 4 = = + + 6 = + + + 7 = = + + 8 = = + + Detergentes Aniónico SDS + + + + Catiónico CTAB = = - - No iónico TritonX-100 - = + - Tween-80 = + = - Proteasa Proteinasa K = + - -
(+) indicador de estabilidad de la actividad antifúngica (-) indicador de disminución de la actividad antifúngica
Resultados y Discusión
64
4.3.3 Caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad antifúngica
in vitro frente a M. fijiensis
Se logró caracterizar los metabolitos semipurificados obtenidos de la fase proteica de los