PROTEÍNA DE INTERÉS
3- Definir el perfil de expresión temporal de los miRNAs desde la fase aguda hasta la fase tardía de la isquemia en el modelo pMCAO para identificar miRNAs
4.5.3 Determinación del perfil de expresión de los miRNAs: Ensayo FlexmiR
Se realizó un cribado para identificar miRNAs diferencialmente expresados en corteza cerebral de rata en respuesta a la isquemia (objetivo 3.1) a través del análisis del perfil de expresión de 442 miRNAs en muestras control y a distintos tiempos después de la pMCAO (30 minutos, 6 horas, 7 y 14 días (n=2/grupo)) mediante el sistema FlexmiRTM microRNA
Assay Kit (Luminex, Austin, Texas, EEUU), ensayo para el que no es necesario enriquecer
la muestra en RNAs pequeños. Concretamente, este kit incluye el kit de marcaje FlexmiTM
MicroRNA Labeling Kit y los paneles de ensayos FlexmiRTM MicroRNA Human Panel (319
miRNAs en 5 pools de microesferas) y el FlexmiRTM MicroRNA Mouse/Rat Panel (123
miRNAs en 2 pools de microesferas). Un pool de microesferas consiste en una colección de 60-100 sondas de captura unidas a una mezcla de microesferas en un mismo vial. Dado que los paneles FlexmiRTM MicroRNA tienen más de 100 ensayos diana, cada kit específico para
cada especie incluye distintos pools para lograr analizar la mayor parte de las secuencias recogidas en la base de datos miRBase. El sistema FlexmiR combina la tecnología de
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sondas Exiqon Locked Nucleic Acid (LNATM) y la tecnología multiplex de microesferas (beads) Luminex xMAP® para crear un array en fase líquida. La integración de estas tecnologías permite la detección de manera precisa de miRNAs sin necesidad de amplificar o fraccionar la muestra de RNA. Cada microesfera lleva en su interior una combinación de fluoróforos específica para cada uno de los miRNAs en el array y lleva unida en su superficie una sonda LNA también específica para cada miRNA, esto permite discriminar entre miRNAs de la misma familia estrechamente relacionados. Las sondas LNA son sondas en las que se ha incorporado un LNA. Este ácido nucleico bloqueado (“locked”) es un análogo de ácido nucleico con una modificación en el anillo ribosa que le proporciona mayor temperatura de melting (Tm), lo que conlleva que las sondas que incorporan este LNA presentan mayor especificidad y sensibilidad que las sondas convencionales en los ensayos de hibridación, permitiendo discriminar entre miRNAs que pueden diferir únicamente en un sólo nucleótido. Asimismo, las Tm de las sondas se han normalizado a fin de optimizar la hibridación bajo las condiciones del ensayo. La corrección de posibles variaciones de marcaje e hibridación entre muestras se realizan mediante microesferas control presentes en cada pool que permiten evaluar la integridad del ensayo y normalizar los resultados intra- e inter-muestras. Además, cada pool contiene un control negativo, agua tratada de manera idéntica al RNA total durante todo el ensayo, que se usa para la sustracción del ruido de fondo (background).
El ensayo consiste en (Figura 4.8):
1. Marcaje con biotina del extremo 3’ del RNA total.
2. Hibridación del RNA marcado con las sondas de captura LNA unidas a la microesfera xMAP marcada fluorescentemente.
3. Detección de los miRNAs biotinilados mediante reacción con estreptavidina-ficoeritrina conjugada (SAPE) a 1mg/ml.
4. Análisis de las muestras en el equipo Luminex 100™ instrument con Luminex100 IS 2.3
software (Luminex), para identificar la microesfera fluorescente y cuantificar la
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Figura 4.8. Esquema de trabajo del ensayo FlexmiR (modificado del manual de instrucciones
del producto BG-FMIR-L20 de Luminex).
Según instrucciones de la casa comercial, los protocolos de biotinilación, hibridación con sonda LNA y marcaje con SAPE de cada una de las muestras para los 7 pools del array fueron los siguientes:
1. Biotinilación:
a. 3850ng de RNA total + 3.85µl de CIP (Calf Intestinal Phosphatase) Buffer + 3.85µl de CIP Enzyme + 3.08µl de Non-B (Non-Biotinylated) Controls + agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 26.95µl. Se incubó la mezcla 10 minutos a 37ºC, 5 minutos a 95º y se mantuvo a 4ºC hasta el siguiente paso
b. 23.1µl de Biotinylation Buffer + 11.55µl de Biotinylation Enzyme, se añadieron a la mezcla del paso a, obteniendo un volumen final de 61,6µl. Se incubó 1 hora a 16ºC, 15 minutos a 65ºC y se mantuvo un máximo de 1 hora a 4ºC hasta el siguiente paso. 2. Hibridación: Se mezclaron los 61.6µl de la reacción anterior con 107.8µl de
Hybridization Buffer + 154µl de agua libre de nucleasas. En una placa de 96 pocillos se
pusieron 8µl de las microesferas de los 7 pools en distintos pocillos y se añadieron 42µl de la mezcla anterior en cada uno. Se incubó 3 minutos a 95ºC y 1 hora a 60ºC, continuando enseguida con el paso 3.
3. SAPE: Se transfirieron los 50µl de cada pocillo a una placa filtrante (Millipore, Billerica, Massachusetts, EEUU) y se realizaron dos lavados con wash buffer precalentado a 60ºC usando un colector de vacio (Millipore) y una bomba (Millipore). A continuación se añadieron 75µl/pocillo de SAPE (1:300) y se incubaron en oscuridad durante 30 minutos
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agitando a 850-900rpm. Pasado este tiempo se transfirieron los 75µl a la placa de lectura y se analizaron las muestras en el Luminex 100™ instrument.
En cada una de las muestras y para cada miRNA de cada uno de los pools se analizaron un mínimo de 100 microesferas y la intensidad media de fluorescencia (MFI, mean fluorescence
intensity) se recogió para el posterior análisis de datos. Sólo los miRNAs con valores de MFI
como mínimo el doble de la intensidad del background en más de dos grupos analizados se consideró fiable y se analizaron con el programa FlexmiR Data Analysis Software, Version 2.0.23.0 (Luminex). Antes del análisis de los datos también se descartaron aquellos miRNAs humanos (hsa-) y de ratón (mmu-) sin homólogo descrito en rata (rno-). El análisis consistió en la sustracción del background individual para cada una de las microesferas y la normalización de los valores de MFI corregidos mediante la opción normalización por cuantiles (quantile normalization) del programa, la cual compara todos los puntos de datos y las intensidades de rango. Mediante análisis de la varianza (ANOVA) se identificaron diferencias significativas y la prueba t de Student se utilizó para comparar cada tiempo después de la pMCAO respecto a la media del grupo control, considerando significativo valores de p<0.05.