Determinantes de las conductas irregulares

Kročková, J.1_{, Massányi, P.}1_{, Sirotkin, A.}2_{, Pivko, J.}1,2_{, Benčo, A}3

1_{Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU, Nitra}

2_{Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra}

3_{Katedra zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF, Nitra}

Abstract

Aim: To study effects of nickel (NiCl2) on production of sexual hormone (progesterone),

ultrastructure and cell apoptosis. Methods: Granulosa cells were aspirated using a 2 ml syringe and separated from the follicular fluid by centrifugation. The medium was replaced with new medium of the same composition containing, in addition, NiCl2 (Sigma, St. Louis,

contained no NiCl2. Quantification of progesterone was performed after 48 h of culture

directly from aliquots of the media from control and treated porcine granulosa cells by RIA. Quantification of apoptosis cells was performed using Tunel assay. From each experiment 20 electron microscopy sections from three different replicates were examined. Results: The highest production of progesterone was found in control group without NiCl2. After NiCl2

administration, there was a decrease of progesterone production.The lowest progesterone production was after addition of 1000 µM NiCl2. Tunel assay detected higher occurrence of

apoptosis after NiCl2 administration. An increased apoptosis in each of experimental groups

apart from concentration of 250 µM NiCl2 with the lowest percentage of apoptosis cells

(42%) was detected. The highest percentage of apoptotic cells was found after administration of 1000 µM NiCl2 (79 %). Also the ultrastructure of granulosa cells was altered after NiCl2

administration. We observed higher frequency of euchromatin in nuclei, lipid drops, microfilaments and vacuoles in cytoplasm after NiCl2 treatment. There was also relatively

lower frequency of mitochondria and smooth endoplasmic reticulum. Conclusion: Our findings suggest a negative effect of NiCl2 on steroidogenesis as well as on the ultrastructure

and death of granulosa cells.

Úvod

Dôležitým ekologickým fenoménom najmä dnešnej doby je skutočnosť, že človek musí koexistovať s nadmerným množstvom chemických látok od začiatku embryonálneho vývoja až po smrť. S rastúcim stupňom znečistenia životného prostredia sa záujem o dôsledky pôsobenia toxických látok na živé systémy zvyšuje. Medzi tieto látky, ktorých je veľké množstvo, patria aj ťažké kovy. Mnohé sú toxické pre človeka, zvieratá ale aj rastliny. Sú schopné sa v organizme ukladať a akumulovať, čo zvyšuje ich toxický účinok. Hlavným zdrojom znečistenia recipientov kovmi sú odpadové vody z ťažby a spracovania rúd, hutí, z povrchovej úpravy kovov, fotografického, textilného priemyslu a iných odvetví. Ďalším zdrojom môžu byť atmosferické zrážky znečistené exhaláciami vznikajúcimi pri spaľovaní fosílnych palív a vyfukovanými plynmi motorových vozidiel. Medzi ťažké kovy patrí aj nikel. V organizme sa podieľa na zabezpečení stability bunkových membrán a ovplyvňuje produkciu niektorých hormónov. Je tiež kofaktorom rôznych mikrobiálnych enzýmov. Pohlavné orgány slúžia ako veľmi citlivý barometer výskytu rizikových prvkov v životnom prostredí. U samíc sa účinky ťažkých kovov najčastejšie prejavujú vo zvýšenej atrézii folikulov vo vaječníkoch ako aj zmenami stavby endometria maternice. Mnohé ťažké kovy výrazne negatívne ovplyvňujú steroidogenézu.

Materiál a metodika

Odber a príprava vzoriek: Vaječníky sme získali od pubertálnych samíc ošípanej plemena Slovenská biela ušľachtilá vo veku 7 mesiacov, tesne na začiatku estrálneho cyklu (vizuálne vyšetrenie stavu vaječníkov). Vaječníky sme uložili do sklenenej nádoby obsahujúcej studený fyziologický roztok, následne sme ich transportovali do laboratória v termotaške na ľadových vankúšikoch. Ihneď sme ich opláchli (1 min.) v 70% roztoku liehu a potom dva krát v sterilnom fyziologickom roztoku. Granulózne bunky sme izolovali z dobre prekrvených folikulov stredných rozmerov ( 3 – 5 mm v diametre) pomocou aspirácie folikulárnej tekutiny so striekačkou a tenkou ihlou pod laminárnym boxom. Zhromaždenú folikulárnu tekutinu v sterilnej skúmavke sme centrifugovali (500g 2000 rpm 10 min pri 4°C). Odstredené folikulárne bunky sme premyli v médiom Hepes–buffered DME/F12. Centrifugácia, obnovenie média a pipetovanie boli opakované trikrát. Počet buniek sme stanovili pomocou hemocytometra a koncentráciu buniek sme upravili na 106.l-1 ml kultivačného média TCM–199, ktoré bolo doplnené s 10% bovinného fetálneho séra a 50 mg antibiotika gentamicin na liter média. Takto upravenú bunkovú suspenziu sme rozpipetovali (2 ml) do kultivačných platničiek. Následne sme bunky kultivovali v CO2 inkubátore pri

37°C, v 5% CO2 vo zvlhčenom vzduchu počas 3 – 4 dní, kým sa nevytvorila súvislá

monovrstva buniek. Životaschopnosť buniek (determinovaná farbením s Trypánovou modrou) bola 75 – 78%. Médium sme potom nahradili novým médiom s rovnakým zložením a s prídavkom NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) v požadovaných koncentráciách 62, 125, 250,

500 a 1000 µM. Kontrolné médium neobsahovalo NiCl2. NiCl2 (Sigma, St. Louis, MO) sme

rozpustili v kultivačnom médiu bezprostredne pred jeho použitím. Pre hodnotenie ultraštruktúry buniek sme po 48-hodinovej kultivácii s niklom alebo bez neho separovali bunky, fixovali v 2% paraformaldehyde a 2,5% glutaraldehyde v 0,2 M fosfátovom bufri pri 4°C 2 hodiny, dehydrovali v zostupnom rade roztoku etanolu a zaliali do epoxydovej živice. Ultratenké rezy sme zafarbili s acetát uranylom a citrátom olovnatým a pozorovali použitím JEM – 100 CX-II (JOEL, Japan). Z každého pokusu sme pozorovali 20 elektrónových mikroskopických rezov z minimálne troch rozdielnych opakovaní. Hodnotenie steroidogenézy: Kvantifikáciu progesterónu a 17-ß-estradiolu sme prevádzali priamo z alikvotného množstva média z kontroly a ošetrovaných buniek pomocou rádioimunometódy (RIA). V pokuse sme urobili 10 opakovaných ošetrení. Steroidy sme merali v slepej kontrole (médium kultivované bez buniek), v kontrole (médium kultivované s bunkami bez NiCl2)

a v experimentálnych skupinách (médium kultivované s bunkami a s NiCl2). Vypočítaním

boli vždy odrátané z obsahov celkových steroidov meraných v médiu kultivovaných buniek k vylúčeniu vplyvu endogénnych steroidov na stanovenie sekrécie steroidov kultivovanými bunkami.

Minimálne detekčné limity pre progesterón boli 0,5 ± 0,02 ng.ml-1 a variácie intra- a inter- metód boli 5,6 % a 7,9 %. Bol použitý izotopový (1,2,6,7-3H)-progesterón so špecifickou aktivitou 3,26 TBq.mmol-1 a protilátky progesterónu. Intra- a inter- variácie 17-ß-estradiolu boli 6,3 % a 9,2 %.

Hodnotenie ultraštruktúry vaječníkov: Z fotografií získaných podľa morfologických kritérií (WEIBEL et al., 1966; MASSÁNYI a UHRÍN, 1996; ŽITNÝ et al., 2004) sme v granulóznych bunkách hodnotili: zastúpenie jadier, mitochondrií, endoplazmatického retikula, tukov, vakuol a mikrofilamentov.

Výsledky

Po podaní jednotlivých koncentrácií NiCl2 granulóznym bunkám sme zistili pokles

produkcie progesterónu u všetkých koncentrácií, pričom najnižšia produkcia tohto hormónu bola pri koncentrácii 1000 µM NiCl2 (3,60 ng.ml-1 média). Najvyššia produkcia progesterónu

bola u kontroly (5,19 ng.ml-1 média) (tabuľka 1, graf 1).

Vplyv NiCl2 na produkciu progesterónu.

Tabuľka 1