La diferenciación a mesodermo de las células madre pluripotentes

Los modelos históricos para el estudio del desarrollo embriológico dieron cuenta de los eventos iniciales y señales moleculares involucradas en la formación temprana del mesodermo. Estos conocimientos fueron aplicados a los desarrollos in vitro que sucedieron a partir de la descripción de las células madre pluripotentes. Estas células representan las etapas iniciales de los estadios del desarrollo embrionario correspondientes a la masa interna del blastocisto. Por su perfil de identidad molecular y funcional son de las primeras células existentes luego de la fecundación con capacidad de generar todos los tipos celulares adultos. Por lo tanto, representan un estadio en donde no han sufrido al momento ningún episodio de TEM. En consecuencia, las CMP representan un modelo único para el estudio de la diferenciación embrionaria, y la TEM en estas células es un paso necesario para generar células mesenquimales diferenciadas (Kim, Yi, Kim, & Choi, 2014; Kovacic, Rosner, Schipany, Ionce, & Hengstschläger, 2015; Nieto, 2013).La TEM entonces es parte necesaria de la aparición del mesodermo primario.

Inicialmente, una manera de estudiar la diferenciación in vitro de las CMP ha sido la generación de los llamados cuerpos embrioides (Itskovitz-Eldor et al., 2000; Kehat et al., 2003). Estos consisten en la agregación de un cúmulo de CMP en forma tridimensional y cultivados en suspensión en un medio rico en señales de diferenciación, el cual consiste básicamente en suero fetal bovino (SFB) con sus factores de crecimiento. Estas señales, sumadas a las señales producidas por las mismas células en diferenciación, generan un microambiente que produce al cabo de algunos días la aparición de células de las tres capas germinales. Este sistema de alguna forma emula in vitro la formación de un teratoma in vivo. Por lo tanto, es posible con este sistema simple identificar células mesodérmicas en mayor o menor grado de diferenciación, e inclusive, prolongado el tiempo de diferenciación suficiente, es posible observar la aparición de derivados mesodérmicos tardíos, tales como zonas contráctiles espontáneas, las cuales representan progenitores cardíacos organizados y funcionales (Scassa et al., 2011).

Los modelos de diferenciación anteriormente descritos, sin embargo, son inespecíficos y generan células de las tres capas germinales. Por lo tanto, en los últimos años se aplicaron los conocimientos originados en modelos in vivo para lograr diferenciaciones celulares específicas de las CMP. Existen diferentes modelos de diferenciación in vitro a partir de CMP basados en la aplicación de factores de crecimiento por los cuales se pueden obtener células progenitoras adultas con un fenotipo definido, como por ejemplo cardiomiocitos (Burridge et al., 2012). Pero para llegar a esta célula con características funcionales definidas las CMP deben transicionar por una serie de cambios que incluyen la TEM y la aparición de un progenitor mesodérmico temprano. Por lo tanto, si bien nos referimos a la TEM y a los progenitores mesodérmicos como entidades únicas, es posible que en un plato de cultivo se reproduzcan de manera ciertamente poco organizada la aparición de diferentes TEM, así como de diferentes progenitores con capacidad de generar mesodermo

(Era et al., 2008). Sin embargo, también ha sido descrita la metodología para el desarrollo de un progenitor mesodérmico único que es capaz de diferenciarse en todas las células adultas derivadas del mesodermo (Evseenko et al., 2010), o de progenitores mesodérmicos estables con restricciones en su capacidad de diferenciación (Kumar et al., 2015). Estos fenómenos son indudablemente más indefinidos en un plato de cultivo que en el desarrollo in vivo, pero los conocimientos desarrollados permiten la reproducción de muchas de las señales y estadios que conducen al desarrollo del mesodermo primitivo.

La transición epitelio-mesenquimal ha sido estudiada en el proceso de diferenciación de las CMP (Behr, Heneweer, Viebahn, Denker, & Thie, 2005; Eastham et al., 2007; Ullmann et al., 2007) (figura 6). Además, el fenómeno inverso de la transición mesenquimo-epitelial también ha merecido

atención al demostrarse que es de vital importancia para la reprogramación celular (Gill et al., 2011; Li et al., 2010; Samavarchi-Tehrani et al., 2010). Las investigaciones realizadas demuestran que los cambios y señales característicos de la TEM observada en modelos de células neoplásicas o en modelos de desarrollo embrionario también suceden en la diferenciación de las CMP a mesodermo. Behr y colaboradores demostraron la existencia de cambios morfológicos celulares, la pérdida de uniones intercelulares, y la aparición de factores de transcripción específicos de mesodermo en colonias de CMP que iniciaban la diferenciación (Behr et al., 2005). Eastham y colaboradores describieron además la aparición de los factores de transcripción específicamente relacionados con la TEM, tales como SNAI y SLUG (Eastham et al., 2007). Además, demostraron la aparición de proteínas relacionadas típicamente con funciones mesenquimales, tales como las metaloproteinasas. Por lo tanto, estas y otras publicaciones demuestran que las CMP son capaces de reproducir los fenómenos de la TEM in vitro antes de diferenciarse en células mesodérmicas (Kovacic et al., 2015).

1.4.3. Señales moleculares involucradas en la formación del mesodermo

El desarrollo embrionario del mesodermo primitivo ha sido extensamente estudiado en modelos animales, y muchos de estos hallazgos han sido confirmados en el proceso de diferenciación de CMPs. Este proceso involucra múltiples señales paracrinas, transducidas por una compleja maquinaria interna de segundos mensajeros y factores de transcripción. Esta señalización ocurre a partir de las diferentes estructuras del embrión en desarrollo, siendo el endodermo visceral particularmente importante en las etapas iniciales al secretar las señales de diferenciación, e inducen la formación de la línea primitiva. Entre las señales críticas para este proceso se encuentran Wnt3, Nodal, Activina-A y BMP4 (Brand, 2003; Tam & Loebel, 2007). Los modelos animales knock-out de estas tres señales resultan en la ausencia de formación de mesodermo.

Los hallazgos en la señalización para la formación de mesodermo pueden ser replicados en la diferenciación de las CMP (Evseenko et al., 2010; Kattman et al., 2011; Mahmood, Harkness, Schrøder, Abdallah, & Kassem, 2010; Tran et al., 2009). Múltiples trabajos reportan similitudes entre el desarrollo embrionario y la diferenciación de las CMP en las señales responsables de la formación de mesodermo. Sin embargo, los procedimientos de diferenciación de las CMP se encuentran limitados por la obvia ausencia de una organización tridimensional propia del desarrollo. Sin embargo, ésta pérdida no impide la diferenciación de las células, y de tal manera que las CMP pueden generar células derivadas de las tres capas germinales. A pesar de no perder esta capacidad, la diferenciación de las CMP acontece en un ambiente en donde no

F i g u r a 6 : Descripción de los fenómenos de transición epitelio-mesenquimal y mesenquimo- epitelial en los diferentes contextos celulares. De izquierda a derecha se observa un gradiente evolutivo de diferenciación. En el extremo izquierdo se encuentran las células madre pluripotentes en su estado más indiferenciado (naïve o ground state). Ligeramente más indiferenciadas, las CMP son habitualmente las cultivadas en los laboratorios. Si se induce la diferenciación de las mismas se transita una transición epitelio-mesenquimal y se generan las estructuras mesoendodérmicas, hasta alcanzar un estado totalmente diferenciado. Se ha demostrado que este camino evolutivo puede ser revertido totalmente por la reprogramación celular (que requiere una transición mesenquimo-epitelial) y la inducción de un estado naïve de las CMP por medios químicos. Actualmente también se considera que las células cancerígenas pueden transitar caminos similares. Adaptado de Kovacic et al., 2015.

existe la tridimensionalidad dada de un embrión en desarrollo, ni los patrones de gradientes de señalización intercelular típico de los morfógenos embrionarios. En parte, esto se suple realizando la diferenciación en pequeñas esferas tridimensionales en suspensión, en las cuales las señales de una células en diferenciación inducen a otras células vecinas influyendo entonces en la diferenciación de las mismas. Se podría decir que la diferenciación de las CMP ocurre de una manera relativamente caótica en este modelo tridimensional, en la cual las señales provenientes del medio se suman a las provenientes de sus pares celulares en una estructura no específica. Así, no es de sorprender que este modelo genere células variadas, sin un patrón definido, y con un resultado algo impredecible. El desafío ha sido en estos años desde su descubrimiento, dominar la diferenciación para lograr células adultas específicas.

La manera de circunvalar este inconveniente ha sido el desarrollo de protocolos de diferenciación específicos. En este caso, las células madre pluripotentes suelen ser expuestas de manera secuencial y homogénea a señales de diferenciación definidas (Murry & Keller, 2008). Para ello, se utilizan períodos de exposición definidos a factores de crecimiento que inducen la aparición de células diferenciadas. A medida que avanza la diferenciación, las células adquieren un fenotipo cada vez más diferenciado. Existen varios ejemplos de derivados mesodérmicos generados con estos protocolos de diferenciación específicos, incluyendo la generación específica de cardiomiocitos (Burridge et al., 2012) , células hematopoyéticas (Kennedy, D’Souza, Lynch-Kattman, Schwantz,

& Keller, 2007), o células endoteliales (Yang et al., 2008), entre muchos otros. En todos los casos, los protocolos específicos utilizan una señalización inicial a un progenitor mesoendodérmico, para posteriormente realizar un patterning específico por medio de factores de crecimiento.

1.5. Diferenciación de células madre pluripotentes en células madre mesen- quimales

Como hemos visto, la propiedad fundamental de las células madre pluripotentes es su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo celular. No es de extrañar entonces que estas células sean capaces de generar in vitro células con un fenotipo similar a las células madre mesenquimales. En etapas muy tempranas de la embriogénesis las células epiblásticas evolucionan hacia una TEM primaria para la formación del mesodermo (Evseenko et al., 2010). Este evento es reproducible in vitro, y a partir de allí es posible generar todos los progenitores derivados de esta capa germinal, incluyendo a células que presentan características similares a las CMM.

La caracterización de las células madre mesenquimales derivadas de células madre pluripotentes (CMM-DP) se ha realizado en forma análoga a la realizada habitualmente en las CMM fetales

y adultas. Es decir, la expresión de marcadores de membrana, la capacidad de diferenciarse a condroblastos, adipocitos y osteoblastos, y la capacidad de inmunomodulación han dado identidad a las CMM-DP. Sumado a esto, en esta población celular es posible caracterizar el proceso de TEM a través del análisis fenotípico de características epiteliales que dan paso a la aparición de características mesenquimales. Sin embargo, no es claro cual es el grado de similitud entre las CMM-DP y las derivadas de tejidos adultos (de Peppo et al., 2010). Las células madre mesenquimales presentes en tejidos fetales y adultos presentan similitudes y diferencias entre sí dependiendo de su origen (Al-Nbaheen et al., 2013; Strioga, Viswanathan, Darinskas, Slaby, & Michalek, 2012). Lo mismo es de esperar que suceda con las CMM-DP, pero esta caracterización esta mucho menos estudiada. Además, existen muchos protocolos para la derivación de CMM-DP,

y es posible entonces que las células obtenidas con cada uno de ellos también presenten algunas diferencias.

Luego de la descripción del método para cultivar CMP humanas en 1998 comenzaron a publi- carse trabajos de investigación en donde se describían diferentes maneras de cultivar las CMP. Originalmente, en la primera publicación, las CME fueron co-cultivadas con fibroblastos em- brionarios de ratón mitóticamente inactivados. Los fibroblastos inactivados generaban señales de pluripotencia a través de la secreción de factores de crecimiento, pero también a través de señales provenientes de la matriz extracelular que secretaban. A fin de evitar la utilización de los fibroblastos, Xu y colaboradores publicaron su experiencia con el cultivo en platos cubiertos con matrices extracelulares alternativas (Xu et al., 2001). Los autores estudiaron el efecto de crecer las CME sobre Matrigel (una matriz extracelular comercial derivada de tejido de sarcoma de rata descelularizado), laminina, fibronectina o colágeno y observaron que particularmente los dos primeros eran óptimos para el cultivo de CME. Pero los autores describieron en sus experimentos que era frecuente observar cómo células localizadas en la periferia de colonias de CME pluripotentes se diferenciaban espontáneamente, y entonces se observaba la aparición de células con un incremento de su citoplasma y ahusamiento de su morfología en comparación con las células pluripotentes lindantes. Si bien estos autores no caracterizaron esta población de células en este trabajo, es posible que esta sea la primera descripción de la existencia de células con un fenotipo mesenquimal que se diferenciaban a partir de CMP. Unos años después los mismos autores publicaron la posibilidad de sostener el cultivo de CMP sobre un co-cultivo de unas células similares, aunque obtenidas de manera diferente e inmortalizadas (Chunhui Xu et al., 2004). Los autores cultivaron las CMP en forma tridimensional por cuatro días en suero fetal bovino, en unas esferas en suspensión llamados cuerpos embrioides; posteriormente adherían las mismas y las cultivaban por 9 días más. En ese momento pasaban las células en estado unicelular hasta obtener un cultivo homogéneo de células con morfología de fibroblastos, y finalmente las inmortalizaban por medio de la infección con un virus conteniendo el gen hTERT. Los autores realizaron una caracterización de las células obtenidas y demostraron la presencia de marcadores de membrana usualmente presentes en CMM, incluyendo a CD29, CD44, CD71, y CD90, en niveles similares a los de CMM adultas. Estas células no expresaban los marcadores CD45 ni CD14. Además, presentaban capacidad de diferenciación osteogénica, aunque no de diferenciarse en adipocitos ni en condroblastos. De esta manera, los autores pudieron identificar la aparición de células con un fenotipo mesenquimal diferenciadas a partir de las CMP.

Poco tiempo después Barberi y colaboradores describieron más en detalle la aparición de una población mesenquimal a partir de las CMP (Barberi, Willis, Socci, & Studer, 2005) . Estos autores desarrollaron un modelo de diferenciación a base de co-cultivo con una línea celular llamada OP9. Esta línea celular fue derivada del cráneo de un embrión de ratón, y posee un fenotipo mesenquimal (Gao et al., 2010). Luego de un co-cultivo extenso de 40 días, realizaron una separación por citometría de flujo para células positivas a CD73, un marcador de células mesenquimales. Posteriormente realizaron una extensa caracterización de las células, las cuales eran positivas para marcadores de estirpe mesenquimal (CD29, CD44, CD105, CD106, CD166, Stro- 1, Vimentina y I-CAM). Además, encontraron que las células podían diferenciarse a adipocitos, condroblastos y osteoblastos. Por último, realizaron además una caracterización de la expresión genética por medio de un microarreglo y lo compararon con células madre mesenquimales de médula ósea (CMM-MO). Los autores encontraron una gran similitud entre los genes expresados

F i g u r a 7 : Correlación de la expresión génica entre las células madre pluripotentes y las células madre mesenquimales. Los paneles A, B y C demuestran gráficamente la correlación de la expresión de genes entre las CMP (hESCs), las CMM-DP (hES-MPs) y las CMM-MO (MSCs). El grado de correlación entre las CMM-DP y las CMM-MO es mucho mayor que entre estas mismas con las CMP, sugiriendo entonces que las CMM-DP presentan un fenotipo mesenquimal. Tomado de de Peppo et al., 2010.

en CMM-DP y las CMM-MO adultas. Además, un gran número de genes expresados por ambos tipos celulares se encontraban directamente relacionados a un fenotipo mesenquimal. En otra publicación realizada por de Peppo y colaboradores (de Peppo et al., 2010) , la correlación de la expresión de genes entre las poblaciones de CMM-MO y CMM-DP fue significativamente mayor que la de las CME con cualquiera de las CMM (figura 7). Estos trabajos iniciales demostraban entonces que bajo ciertas condiciones, no muy exigentes, las CMP perdían las características de la pluripotencia y adquirían un fenotipo mesenquimal.

Un año más tarde una nueva técnica de generar las CMM-DP fue publicada, a la que los autores llamaron raclure, palabra que en francés se traduce como raspado"(Olivier, Rybicki, & Bouhassira, 2006) . Básicamente, este método consistía en obtener las células diferenciadas a partir de un cultivo de células madre pluripotentes por medio de la sección mecánica de las células con un fenotipo mesenquimal. Los autores reportan que estas células presentaban características epiteliales en un principio, aunque esta aseveración no parece sustentada por ninguna evidencia.

F i g u r a 8 : Capacidad de inmunomodulación de las CMM-DP. Los autores realizaron un ensayo de proliferación de linfocitos estimulados y fueron expuestos de diferentes maneras a las CMM-DP (contacto directo, separado por una membrana (tranwell), o utilizando su medio condicionado). Como se observa, las CMM-DP derivadas de CMEh (H1, H7 y H9-MSCs) y las CMM-MO (BM-MSCs) generaron una disminución marcada y equivalente de la proliferación de linfocitos en cualquiera de las diferentes formas de exposición. Tomado de Trivedi & Hematti, 2008.

Posteriormente, las células se diferenciaban y adquirían características de CMM-DP, basado en los receptores de superficie y de la capacidad de diferenciación multipotente. Un par de años más tarde, una forma ligeramente diferente de lograr CMM-DP fue publicada por Trivedi y colaboradores (Trivedi & Hematti, 2008) . Estos autores básicamente extendían la frecuencia del cambio de medio de cultivo a las CMP. Esto producía seguramente un agotamiento de los factores que mantienen en estado indiferenciado a estas células, y con los días aparecían células que eran posteriormente disecadas en forma manual y pasadas para su cultivo independiente de las CMP. Las células con el correr de los días se transformaban así en CMM-DP. Además, los autores demostraron por primera vez que estas células eran potentes inmunomoduladoras in vitro, tal como es ampliamente observado con CMM de otros orígenes (figura 8).

La descripción de estos procedimientos para la diferenciación de CMP en CMM llevó a que se desarrollen protocolos específicos y definidos para este procedimiento. En el campo de la investigación en CMP es habitual que los investigadores lleven adelante estudios en donde a partir del conocimiento de las señales involucradas en el desarrollo embriológico de los tejido adultos se generen protocolos en donde se reproduzcan las condiciones embrionarias por medio de la incorporación de factores de crecimiento específicos o de inhibidores de la transducción de señales intracelulares. Además, el interés por la utilización de protocolos de diferenciación específicos también radica en la posibilidad de la no utilización de derivados de origen animal (por ejemplo, suero fetal bovino), y de componentes definidos en concentraciones definidas, condición muchas veces necesaria en procesos industriales. Es así que comenzaron a publicarse protocolos de diferenciación de CMP a CMM-DP que contienen factores de crecimiento tales como BMP4 o Activina-A, componentes activos y tempranos de la diferenciación a mesodermo. Uno de estos pri-

meros protocolos fue publicado por Kimbrel y colaboradores (Kimbrel et al., 2014). Estos autores utilizaron un procedimiento complejo que involucra primero el cultivo tridimensional (en forma de cuerpos embrioides) y posteriormente el pasaje a dos dimensiones, y el cultivo con un medio definido conteniendo los factores de crecimiento bFGF, VEGF, BMP4, y trombopoyetina suspen- didos en un medio comercial sin componentes animales (Stemline II, Sigma). En otra publicación, Wu y colaboradores usaron un inhibidor de la quinasa Rho (conocido como inhibidor de ROCK Y-27632), los suplementos N2 y B27 (utilizados habitualmente para diferenciaciones neuronales), y bFGF (Wu et al., 2013). De manera más sofisticada y compleja, este protocolos demuestra que es posible la diferenciación de las CMP a CMM-DP utilizando un medio definido.

Las publicaciones existentes acerca de la diferenciación de las CMP en CMM-DP es amplia y puede ser consultada en el apéndice. Una revisión rápida de la lista de publicaciones evidencia que existen dos grandes períodos en la investigación de las CMM-DP. La primera comprende los artículos descritos anteriormente, en los cuales se describen diversas metodologías para la diferenciación de CMP en CMM-DP. En la segunda, correspondiente a los últimos años, se describen diferentes aplicaciones pre-clínicas de las CMM-DP. Estas aplicaciones se relacionan a diferentes modelos fisiopatológicos en animales, y emulan a la literatura desarrollada con células madre mesenquimales de otros orígenes. Los estudios describen en general efectos ampliamente positivos, y en algunos casos incluso con mayor eficacia que células madre mesenquimales de otros