CAPÍTULO 3: MATERIALES SELECCIONADOS Y
4.3. Resultados y Discusión
4.3.8. Difracción de rayos X de los complejos ADN-F
Se obtuvieron por liofilización complejos sólidos de color blanco, que se almacenaron en envases de vidrio ámbar y protegidos de la humedad.
El ADN, como la mayoría de los polímeros, presenta un patrón de difracción nulo, correspondiente a un sólido amorfo, que se caracteriza por presentar una banda dispersa de baja intensidad a lo largo de todo el espectro de 2θ / θ. En cambio, los F cristalinos producen un espectro de rayos X característico, presentando picos intensos a determinados valores de 2θ / θ.
(a)
Figura 4.9 (a) Difracción de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Li y Li como F modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ.
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Patron de difracción de Rayos X
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ADN-Na ADN-Pr50 Pr (b)Figura 4.9 (b) Difracción de rayos X de ADN-Na, de los complejos iónicos ADN-Pr y Pr como F modelo seleccionado, en el intervalo 2θ/θ.
En las figuras 4.9 (a) y (b) se muestran los patrones de rayos X característicos para los F seleccionados como modelo de molécula contraión (Li y Pr respectivamente), del polímero y de los complejos iónicos. Como puede observarse, el ADN-Na, presenta un diagrama de difracción nulo, una banda dispersa de baja intensidad semejante a otros PE estudiados. En contraste los F presentan un difractograma de sólido cristalino.
En los difractogramas de los complejos obtenidos por liofilización, desaparecen las señales del F cristalino completamente al 40% de neutralización, asemejándose al de sólido amorfo.
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Respecto al comportamiento de los complejos PE-F, obtenidos por interacción iónica entre un F cristalino con un PE. Estos dan origen a un material amorfo, con ausencia de F libre, que se adjudica a la alta condensación iónica del F con el PE. (Jiménez-Kairuz A, 2004; Ramírez M, 2006; Quinteros D, 2008; Esteban S, 2009).
Finalmente, se procedió a la redispersión de los complejos sólidos en la misma proporción de agua Milli-Q inicial, observándose las mismas características visuales de las dispersiones originales, sin presencia de precipitados o turbidez. La determinación de la recuperación de las demás propiedades fisicoquímicas se procederá en etapas posteriores a ser evaluadas.
4.4. Conclusiones
La reacción entre dispersiones acuosas de ADN-Na o ADN-NaR y
diferentes proporciones de las sales de los F utilizados, generan complejos estables que permiten vehiculizar concentraciones de F superiores a la solubilidad de sus formas no protonadas.
Los resultados que se reportan en este capítulo son consistentes con la interpretación basada en la ecuación 6.
La incorporación al ADN de proporciones crecientes de los F genera una
progresiva disminución del pH, lo que es consistente con la alta acidez de los grupos fosfato (pKa≈1) y la basicidad de las aminas alifáticas (pKa = 7,95 - 9,53), genera también un aumento de conductividad debido a la liberación de los contraiones Na+ y Cl- de alta movilidad electroforética.
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En todos los casos produce una progresiva disminución del alto potencialelectrocinético negativo de ADN-Na, que es consistente con la formación de pares iónicos [R- FH+]. A su vez, disminuye la movilidad
electroforética de las macromoléculas, lo que puede interpretarse por la disminución de las cargas netas y aumento del peso molecular.
La técnica definida para la determinación cuantitativa de la afinidad ADN- F resultó ser idónea para el sistema estudiado, debido a que como se informó mediante la figura 3.7, la membrana de 12,000 D es efectiva para evitar el pasaje de la sal sódica del ADN. Además, la técnica permite conservar la integridad del biopolímero, como no sucedería con el uso de solventes orgánicos.
El análisis de la determinación cuantitativa de la afinidad, evidenció que una alta proporción de los F ensayados se encuentra unida a los grupos fosfato de los ADN en forma reversible exhibiendo constantes de afinidad (Kpi) en el intervalo 104 – 107.
Las Kpi para los F con mayor basicidad (At, Pr) exhiben valores más altos que los F con menor basicidad (Li).
El sistema es sensible a la adición de sales neutras que disminuyen progresivamente el valor de las Kpi, pero pone en evidencia que la afinidad de las especies protonadas FH+ es mucho mayor que la de los
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Los resultados pueden interpretarse mediante la ecuación 6, lo que pone de manifiesto que el ADN se comporta en forma análoga a otros PE ácidos estudiados previamente. La tabla 4.5 presenta datos comparativos de las Kpi de F con mayor (At, Pr, Me) y menor basicidad (Li), como acomplejantes de PE lineales con grupos ácidos de diferente fuerza (ADN pKa≈1.0, HA pKa≈2 y EL, ES pKa≈6)
Del análisis comparativo con otros PE, se observa que los valores de Kpi para el ADN son similares al HA, estos son mayores que los obtenidos con los Eudragit® ( EL, ES), y a su vez, EL y ES tienen Kpi similares.
Tabla 4.5. Comparativo de la distribución de especies en el equilibrio y log Kpi de complejos PE-Fx
Donde EL: Eudragit L; ES: Eudragit S; AH: Ácido Hialurónico; Me: Metoclopramida
Complejo [mol %] Fx Distribución de Especies (%) Log Kpi [R-FH+] FH+ F EL-Li 25 50 86,80 76,24 12,40 33,31 0,80 1,45 3,45 3,23 ES-Li 25 88,60 8,60 2,80 3,02 50 82,86 13,64 3,49 3,02 EL-Me 50 49,74 50,22 0,04 4,55 ES-Me 50 68,50 31,41 0,09 4,59 AH-Li 25 56,07 42,99 0,94 4,25 50 62,23 36,99 0,77 4,36 AH-Pr 25 60,63 39,64 0,02 5,89 100 78,56 21,42 0,02 6,14 ADNR-At X 29,30 40,77 96,70 93,19 3,30 6,80 0,003 0,011 6,49 6,66 ADNR- Pr X 30,77 55,13 88,45 68,25 11,54 31,74 0,01 0,02 6,63 6,28 ADNR- Li X 30,74 50,93 53,04 70,29 45,73 29,03 1,21 0,69 4,40 4,93
En este capítulo se estudia la cinética y el mecanismo de liberación in vitro de F modelos desde los complejos iónicos ADN-F, y los factores que pueden contribuir a modificar la liberación, entendiendo el proceso molecular y fisicoquímico que se da lugar, y a partir de esta base predecir el comportamiento que los sistemas tendrán in vivo.