El discurso del enfoque de derechos

To  understand the interaction  of Zuotin and Ssz1 on a structural  basis,  crystallization  experiments were conducted (see 2.6.3.1). Previous experiments with wt RAC did not result  in any crystals153, and since the major interest was to investigate the interaction of RAC’s  subunits, the complex of S. cerevisiae Ssz1 and zuo1‐50 was used. 

For the initial crystallization experiments highly purified HisRAC50 (Figure 19) was used,  consisting of N‐terminally 6xHis‐tagged Ssz1 and zuo1‐50. Crystals could be obtained from  the robot screen at a concentration of 10 mg/ml HisRAC50 in condition F12 of JBScreen  Classic HTS I (Jena Bioscience) after four days. This condition contains 8 % w/v PEG 8000,   200 mM LiCl, and 50 mM MgSO4.  

The condition was manually refined and crystals could be reproduced in several conditions.  The best of those were i) 6 % w/v PEG 8000, 200 mM LiCl, and 100 mM MgSO4 (Figure 19A)  and ii) 6 % w/v PEG 8000, 450 mM LiCl, and 50 mM MgSO4 (Figure 19B). The crystals from all  conditions were similar in size and shape. Each drop yielded many crystals, growing as thin,  layered plates. Many of those plates were bent, intergrown, or showed irregular edges or  roundish corners. The largest ones grew to x/y‐dimensions of about 90 x 90 µm (Figure 19A).  Values for the z‐dimension could not be determined since the crystals were too thin. Micro‐  and macro‐seeding experiments (see 2.6.3.2) did not improve crystal quality. The largest and  best defined crystals were harvested (see 2.6.3.3) and various cryo‐protectants were tested:  15 % 2,3‐butanediol, 30 % glycerol, 25 % ethylene glycol (ethane‐1,2‐diol), or 25 % MPD   (2‐methyl‐2,4‐pentanediol). The crystals were stable in 2,3‐butanediol or glycerol, while they  cracked and dissolved quickly in ethylene glycol or MPD. X‐ray diffraction was measured for 

R e s u l t s:   R i b o s o m e ‐ a s s o c i a t e d   c o m p l e x   

the frozen crystals at the SLS synchrotron (Switzerland). All measured crystals were protein  crystals, as could be judged from the diffraction patterns. However, the diffraction quality  was very anisotropic and limited to ~10 Å along the best axis. No dataset was recorded.   

  Figure 19. Crystallization of truncated RAC

Gels. SDS‐PAGE analysis of gel‐filtration peak fractions for representative HisRAC50 or RAC50 purifications.  

A & B. HisRAC50 crystals from manually refined conditions. C. RAC50 crystals with i) irregular edges and 

corners or ii) multiple layers. D. Drop with RAC50 crystals after micro‐seeding. Many intergrown crystals along 

the streak line and some individual ones towards the sides.   

In an effort to improve crystal quality, the 6xHis‐tag was removed from the Ssz1 subunit on  the DNA level and the complex was purified without using any tag. Crystals could be  obtained from RAC50 (wt Ssz1 and zuo1‐50) samples under various conditions (Table 5) at  proteins  concentrations  between 8  –  13 mg/ml.  The  most promising  conditions  were  manually refined. Crystals needed 1 – 4 days to grow. Their appearance was similar to that  of the crystals obtained for purified HisRAC50. Irregular shapes and intergrown, multi‐ layered crystals were frequently obtained (Figure 19C). A variety of techniques was used to  improve crystal quality or shape: i) micro‐ and macro‐seeding, ii) variation of drop size and  buffer to protein ratio; iii) reductive methylation of surface exposed lysine residues154,   iv)  crystallization  in the presence of  ATP  or  AMPPNP, v) screening for other  additive  compounds that might improve crystallization using Additive Screen (Hampton research),   vi)  screening  of  pH  values,  vii)  crystallization  using  the  NV10  compound  (Expedeon),   viii) incorporation of selenomethionine into the protein complex, ix) crystallization in gel155,  x)  crystallization  with  paraffin  oil  covered  reservoirs,  and  xi)  screening  of  various  crystallization temperatures. No crystals of different shape could be obtained. Micro‐seeding  yielded some crystals of improved quality as could be judged in the light microscope. 

R e s u l t s:   R i b o s o m e ‐ a s s o c i a t e d   c o m p l e x   

  However, their general shape did not change, either (Figure 19D). The best crystals were  obtained  at  a  concentration  of  9  mg/ml  RAC50  in  i)  7.1  %  w/v  PEG  4000,   210 mM sodium acetate pH 5.5, and 100 mM sodium citrate pH 5.5 or ii) 6.5 – 7 % w/v PEG  4000,  150  mM  sodium  acetate  pH  5.5,  and  100  mM  sodium  citrate  pH  5.5  using   micro‐seeding. Selected crystals were harvested and x‐ray diffraction was recorded at the  ESRF (Grenoble) synchrotron. The quality of diffraction was anisotropic and most diffraction  spots showed high mosaicity. With respect to the HisRAC50 crystals the diffraction slightly  improved to 8 Å along the best axis, however, it was still not good enough for structure  determination. No dataset was recorded. 

Table 5. Commercial screen condition hits for RAC50 crystallization

Screen name – condition number Chemical composition Protein concentration

JBScreen Classic HTS I – D5 (Jena Bioscience)  10 % w/v PEG 4000 10 % w/v 2‐propanol  100 mM sodium citrate pH 5.6  10 mg/ml 

JBScreen Classic HTS I – F12 8 % w/v PEG 8000 200 mM LiCl 

50 mM MgSO4 

13 mg/ml 

JBScreen Classic HTS I – G2 10 % w/v PEG 8000 100 mM HEPES pH 7.5 

200 mM CaCl2 

13 mg/ml 

Protein Complex Suite – A5 (QUIAGEN) 

15 % w/v PEG 550 MME 100 mM MES pH 6.5 

13 mg/ml 

Protein Complex Suite – B3 10 % w/v PEG 4000 200 mM sodium acetate 

100 mM sodium citrate pH 5.5 

10 mg/ml 

Protein Complex Suite – D7 15 % w/v PEG 6000

100 mM sodium citrate pH 5.5 

13 mg/ml 

Protein Complex Suite – E2 8 % w/v PEG 8000

100 mM sodium citrate pH 5 

13 mg/ml 

Protein Complex Suite – E3 8 % w/v PEG 8000 200 mM NaCl 

100 mM sodium cacodylate pH 6 

10 mg/ml 

Protein Complex Suite – F10   1 M (NH4)2SO4

100 mM Tris pH 8 

13 mg/ml