Técnicas Inmunohistoquímicas para la Detección de las Catecolaminas
El empleo de anticuerpos frente a las enzimas de síntesis de las catecolaminas supuso un gran avance en el conocimien- to de la distribución de los sistemas catecolaminérgicos (CA) en el SNC de los vertebrados. La especificidad en el marcaje con estos anticuerpos obtenidos en mamíferos, resultó ser muy alta cuando se aplicaron en el encéfalo de otras especies de vertebrados no-mamíferos. En particular, los anticuerpos co- ntra la enzima TH se han empleado de forma generalizada en numerosas especies representativas de las distintas clases de vertebrados, demostrando su especificidad en el marcaje de las estructuras CA (Smeets y Steinbusch, 1990; Smeets y Gonzá- lez, 2000). Por el contrario, la reactividad cruzada interespecí- fica de los anticuerpos frente a las enzimas DBH y PNMT, implicadas en la conversión de la DA en NA y de ésta en adrenalina respectivamente, ha resultado ser menos efectiva. Con el desarrollo de anticuerpos frente a la dopamina y la noradrenalina fue posible la demostración directa de estos neurotransmisores en el encéfalo de vertebrados. Sin embargo, los anticuerpos frente a la adrenalina resultaron menos efecti- vos en el marcaje de las estructuras adrenérgicas, de manera que los datos existentes sobre la distribución de este neuro- transmisor se deben fundamentalmente a los estudios realiza- dos con inmunohistoquímica para la enzima PNMT.
Fig. 2. Esquemas representativos de las principales aferencias catecolaminérgicas a la médula espinal, el techo mesencefálico y la región sep- tal en el anuro Rana perezi.
En los anfibios, los anticuerpos frente a la DA y las enzi- mas TH y DBH dan lugar a un patrón específico y constante de inmunomarcaje de los sistemas CA en todas las especies analizadas hasta el momento, lo que demuestra la utilidad de estos anticuerpos (González y cols., 1993, 1994, 1995; Gonzá- lez y Smeets 1991, 1993, 1994a,b 1995). En nuestro estudio, la inmunohistoquímica para la enzima TH se ha utilizado para demostrar la distribución de las fibras y terminales CA en la médula espinal, el techo mesencefálico y el septo de varias especies de anfibios (Rana perezi, Xenopus laevis, Pleurodeles
waltl y Dermophis mexicanus). Mediante la inmunodetección
de esta enzima no se puede distinguir entre las distintas estruc- turas que contienen DA, NA o adrenalina en el SNC. Sin em- bargo, ya que las células dopaminérgicas (DA) y noradrenér-
gicas (NA) constituyen poblaciones celulares separadas en el encéfalo, su auténtica naturaleza se puede inferir en base a su localización topográfica, excepto en el núcleo del tracto solita- rio donde se han encontrado células DA, NA y adrenérgicas. El uso de anticuerpos frente a DA revela la presencia de una subpoblación de células TH positivas responsables de la iner- vación dopaminérgica. Del mismo modo, el empleo de inmu- nodetección de la enzima DBH revela la presencia de estructu- ras NA y adrenérgicas en el SNC (Smeets y Steinbush, 1990). Es importante destacar que hemos encontrado diferencias en la morfología de las fibras y terminales marcados mediante el empleo de inmunohistoquímica para la TH o la DBH. En general, la inmunodetección de la enzima TH revela fibras largas y varicosas, con segmentos intervaricosos claramente
estos segmentos son difícilmente visibles, marcando solamen- te las varicosidades. Una posible explicación para estas dife- rencias morfológicas es la distribución axonal de estas enzi- mas. Así, la TH se localiza en el citosol, mientras que la DBH está presente en las vesículas sinápticas que se pueden acumu- lar específicamente en las varicosidades (Venter y cols., 1988; Pickel y cols., 1996). Este hecho podría explicar la presencia de inmunorreactividad para la TH en toda la fibra, mientras que el marcaje para la DBH aparece sólo en las varicosidades.
Técnicas de Trazado Axonal con Dextranaminas
En el presente trabajo se han utilizado diferentes aproxi- maciones en el empleo de las técnicas de trazado axonal, va- riando tanto el tipo de trazador utilizado como el modo de aplicación del mismo. Hemos empleado una aproximación in
vivo para la aplicación del trazador en regiones de fácil acceso
mediante microcirugía, como es el caso de la médula espinal o el techo mesencefálico (Capítulos 2, 3 y 5). La aplicación de las dextranaminas in vivo se ha utilizado con gran éxito en estudios previos, y ha demostrado ser una herramienta muy útil y eficaz para el trazado axonal, comparado con otras ma- cromoléculas como la peroxidasa de rábano o el complejo cobalto-lisina (Marín y cols., 1997a). En el análisis del desa- rrollo ontogenético de las conexiones descendentes y las afe- rencias CA espinales, empleamos técnicas de trazado in vitro con embriones y larvas de Xenopus laevis (Capítulo 4). Final- mente, en el estudio de las aferencias a la región septal (Capí- tulo 6), debido a la dificultad de acceder al sitio de interés así como de realizar aplicaciones restringidas sin contaminar zo- nas cercanas o de paso de fibras, combinamos aproximaciones
in vivo e in vitro en la aplicación de las dextranaminas, tanto
en forma de cristales como en solución inyectada iontoforéti- camente. El uso de preparaciones del SNC in vitro en anfibios se ha utilizado en trabajos previos para experimentos de traza- do no sólo en el SNC adulto (Luksch y cols., 1996; Roth y Westhoff, 1999) sino también en estudios de desarrollo (A. Muñoz y cols., 1996; Marín y cols., 1997c). En nuestro traba- jo, esta nueva aproximación en la aplicación de las dextrana- minas se ha probado mediante inyecciones iontoforéticas en el cerebro adulto de Rana. El uso de trazado axonal en aplicacio- nes in vitro presenta una serie de ventajas que hacen que sea un método de trazado muy atractivo. En primer lugar, no exis- ten problemas de superviencia y prácticamente todas las partes del cerebro son accesibles al mismo tiempo. Asimismo, ofrece la ventaja de conseguir aplicaciones restringidas y más preci- sas del trazador que siguiendo una aproximación in vivo. Además, la preparación aislada del SNC completo en anfibios se puede mantener “viva” durante varios días permitiendo estudios inmunohistoquímicos, electrofisiológicos y de traza- do sin signos de degeneración en el tejido (Luksch y cols., 1996). Nuestro trabajo también demuestra que el patrón de marcaje en los experimentos in vitro es comparable con los resultados obtenidos siguiendo una aproximación in vivo. Sin embargo, hay que destacar que en los experimentos en condi- ciones in vitro, el marcaje retrógrado de proyecciones largas es menos numeroso que en la aproximación in vivo. Una posi- ble explicación es que, a pesar de que el trazador utilizado en estos experimentos es de menor peso molecular, el tiempo de transporte está también limitado. Además, las aplicaciones iontoforéticas utilizadas en los experimentos in vitro siempre son más restringidas que los cristales, y por tanto, se libera menos cantidad de trazador en el lugar de inyección.
Así, la aplicación de estos trazadores en forma de cristales resulta más eficaz en un transporte retrógrado, mientras que las inyecciones iontoforéticas dan lugar a un transporte ante- rógrado más efectivo. Como hemos mencionado anteriormen- te, las aplicaciones iontoforéticas resultan más apropiadas para un marcaje más restringido, particularmente cuando se quiere obtener información detallada sobre conexiones dentro de una estructura determinada. Por el contrario, la aplicación de cris- tales da lugar a un mayor número de neuronas marcadas retró- gradamente, aunque tiene la desventaja de que los sitios de aplicación son mayores.
Por último, la eficacia de diferentes trazadores también va- ría en función de su peso molecular y de las moléculas con las que están conjugadas para su posterior visualización. En el presente trabajo hemos empleado como trazadores dextrana- minas conjugadas con biotina (BDA) o asociadas a moléculas fluorescentes como Texas Red™ (TRDA). Las dextranaminas biotinadas presentan la ventaja de que dan lugar a un marcaje de las neuronas que recuerda a las tinciones de Golgi, mos- trando claramente la morfología del soma y sus dendritas. Por el contrario, las dextranaminas fluorescentes dan mejor resul- tado cuando se aplican como cristales, aunque la morfología de las células marcadas es menos clara. Por otro lado, la utili- zación de dextranaminas de bajo peso molecular ha resultado más apropiada para estudios de desarrollo o en individuos adultos siguiendo una aproximación in vitro, debido a que se transportan más rápidamente que las de mayor peso molecular empleadas para aplicaciones in vivo (Fritzsch, 1993).
Métodos de Doble Marcaje
Mediante el empleo de técnicas de trazado retrógrado en combinación con inmunohistoquímica para la enzima TH, en el presente trabajo hemos determinado los centros de origen de la inervación catecolaminérgica en la médula espinal, el techo mesencefálico y la región septal. En estos experimentos de doble marcaje, el trazador TRDA presenta la ventaja de que es directamente fluorescente y por tanto, el tejido se puede pro- cesar inmediatamente después de ser cortado para la inmuno- fluorescencia de la TH. Sin embargo, como hemos menciona- do anteriormente, el uso de BDA como trazador resulta tam- bién muy apropiado, aunque su visualización requiere la incu- bación del tejido con una estreptavidina fluorescente que nos permita revelar la presencia de las células doblemente marca- das.