Las técnicas inmuhistoquímicas han constituido y constituyen una metodología de amplia utilización que permite, con el empleo de anticuerpos específicos, la identificación de tipos y estadios de diferenciación celular85 y la localización de
moléculas o estructuras particulares en un tejido. 88, 90 Los anticuerpos constituyen el
componente fundamental en una técnica inmunohistoquímica y su calidad determina en gran medida el éxito del ensayo.
La disponibilidad de anticuerpos policlonales que fueron producidos en conejo contra sticholisina I y II, nos permitió emprender la tarea de localizar estas citolisinas en el cuerpo de la anémona Stichodactyla helianthus, de donde fueron extraídas mediante
un procedimiento de purificación a partir de un extracto total.70 Lo primero que se hizo fue evaluar si tales anticuerpos tenían la calidad requerida para un estudio inmunohistoquímico. Esta calidad está relacionada con la especificidad y potencia de los mismos. La especificidad significa que los anticuerpos fueran lo suficientemente selectivos para no reaccionar con otros componentes de la anémona. De esta forma, la tinción positiva correspondería exclusivamente a la identificación de la sticholisina en el tejido.
En el enfrentamiento de los anticuerpos anti-St I y II al extracto total y a las sticholisinas purificadas en una técnica de inmunotrasferencia se pudo constatar que ningún otro componente del extracto, que no fueran las St I y II, fue capaz de reaccionar con esos anticuerpos (resultados no mostrados), lo que significa que son específicos y que es posible su empleo para localizar las citolisinas en el cuerpo de la anémona.
Es importante reflexionar acerca de que si queremos localizar las citolisinas en el cuerpo de la anémona sin un conocimiento previo de su ubicación en el tejido, tenemos que estar seguros de que los anticuerpos no reaccionen con otras estructuras del animal. Este criterio no puede ser establecido con las técnica inmunohistoquímica en sí
misma, pues no existe un control que permita definirlo, ya que la reacción de posibles contaminantes con otros constituyentes del tejido de la anémona es también una reacción específica. La especificidad de los anticuerpos es el criterio al que nos hemos referido y evaluamos a través del enfrentamiento de los anticuerpos anti sticholisinas con el extracto total y las sticholisinas mediante la técnica de inmunotransferencia. No obstante, existe un procedimiento para evaluar la especificidad del método inmunoquímico y es su absorción con el antígeno para ser enfrentado, una vez absorbido el antisuero, con el tejido bajo estudio. El resultado negativo al enfrentar los anticuerpos absorbidos con el tejido que contiene las sticholisinas nos permitiría confirmar la especificidad del método, el inconveniente de este procedimiento es que se debe disponer de un antígeno altamente purificado en cantidad suficiente, esto es a menudo imposible para antígenos aislados de material biológico. Sin embrago, aun cuando una preparación antigénica suficientemente pura estuviera disponible, el ensayo de preabsorción solo muestra que componentes inmunorreactivos del tejido y este componente, comparten determinantes antigénicos.88, 90 Una alternativa para evaluar la especificidad de los anticuerpos que se utilizarán en el estudio inmunohistoquímico, es emplear un suero normal de la misma especie en la que se produjo el anticuerpo. La reacción negativa de este suero control significa que no existe otros componentes en el suero, como los anticuerpos naturales, capaces de reaccionar con el tejido bajo estudio.85 Esto reafirmaría que la tinción inmunohistoquímica positiva solo es debida a la reacción de los anticuerpos específicos con el antígeno que se desea localizar.
El otro aspecto que debimos resolver fue la selección de los anticuerpos que utilizaríamos en el estudio inmunohistoquímico, dado que disponíamos de anticuerpo contra las dos sticholisinas. ¿Deberíamos trabajar con los dos anticuerpos separadamente y emplear una tinción bicolor, con una mezcla de los dos anticuerpos o con un solo tipo de anticuerpo? El estudio de reactividad cruzada de ambos antisueros
78, evidenció la elevada similitud antigénica de la St I y II, como corresponde a
isoformas de una misma proteína.10 El por ciento de reactividad cruzada de ambos antisueros con la sticholisina heteróloga a todas las diluciones y con los dos
adyuvantes utilizados (Freud y alúmina) fue siempre mayor del 85 % (resultados no mostrados) lo que sugirió una reactividad cruzada verdadera, es decir que ambas proteínas comparten, todos sus epítopos.75, 76 Por todo esto decidimos emplear un solo
tipo de anticuerpo para identificar las dos isoformas de St I y II y seleccionamos los anticuerpos anti-St I obtenidos con alúmina atendiendo a su mayor disponibilidad. Esto nos permitió, además, utilizar el método indirecto de tinción que permite amplificar la interaccion antígeno- anticuerpo primario.77
Para la inmunohistoquímica se empleó el método indirecto, que permite amplificar la interacción antígeno-anticuerpo primario*. Se utilizaron dos anticuerpos: el anti-St obtenido en conejo y el anti-IgG de conejo obtenido en carnero. La capacidad de alguno de estos dos anticuerpos de generar reacciones inespecíficas con el tejido bajo estudio podría conducir a positividades falsas o a una tinción de fondo que podría afectar la resolución de la tinción inmunohistoquímica. Los ensayos preliminares que llevamos a cabo tuvieron como objetivos detectar cualquier tipo de reactividad que no fuera la de los anticuerpos anti-St con las sticholisinas, para proceder a su eliminación y garantizar la especificidad del método inmunohistoquímico.85
Uno de los resultados más interesantes de nuestro trabajo es que si bien la IgG normal de conejo no generó reacción positiva por sí misma al ser enfrentada al tejido de la anémona; sí la generó la IgG del carnero que se conjugó con la peroxidasa. Estas reacciones que acostumbramos a llamar “inespecíficas”, constituyen uno de los obstáculos más importantes a resolver en los ensayos inmunoquímicos. Sus causas son diversas y complejas, así como las formas de eliminarlas.88, 90 El conjugado u otros
anticuerpos pueden unirse electrostáticamente a proteínas básicas en la selección del tejido (interacción proteína-proteína). Tal unión no específica parece ser difícil de eliminar y puede incluso ser facilitada durante la preparación de los anticuerpos marcados. Sterbernger, desde 1979, planteó que al menos parte de esta reactividad no específica puede ser prevenida por pre incubación del tejido con suero pre inmune del animal que sirvió como fuente del segundo anticuerpo,85 por lo que en nuestro caso, decidimos emplear el suero de ternera fetal y el suero normal de carnero como
bloqueadores y el Tritón X-100 como diluyente del primer anticuerpo, lo que permite una mejor penetración de los anticuerpos y disminución de la tinción de fondo debido a la adherencia no específica de anticuerpos al tejido, en siete combinaciones diferentes. Tanto el SNC como el Tritón X-10 ya habían sido utilizados en otras tinciones inmunohistoquímicas con el mismo fin.85 Los mejores resultados se obtuvieron con el empleo de los bloqueadores y el detergente, lográndose una disminución de la tinción de fondo y, por consiguiente, resultados positivos contrastantes, siendo esto uno de los elementos más importantes en la calidad de una respuesta inmunohistoquímica.88, 90 (Figura 7)
En relación con la potencia de los anticuerpos, pudimos comprobar su calidad al obtener tinciones francamente positivas con una dilución 1/4000. Esto puede estar relacionado, no solo con la concentración de anticuerpos de la preparación, sino con su avidez, a la que contribuye la afinidad de los anticuerpos individuales que, por haberse levantado contra un antígeno timo dependiente, sufrieron un proceso de maduración en estos órganos de respuesta.109
La tinción inmunohistoquímica nos permitió identificar las sticholisinas en los tentáculos y la boca de la anémona Stichodactyla helianthus, apreciándose una coloración pardo-
dorado granular, característica de la reacción de la DAB con la peroxidasa, tanto en células epidérmicas como gastrodérmicas. Basándonos en la descripción histológica de de la Torre 31 y Barnes y Ruppert 30 se pudo concluir que estas células eran cnidocitos, lo cual resulta comprensible teniendo en cuenta que es en este tipo de célula, característica de los cnidarios; donde se almacenan las toxinas de estos animales. Además, estas células se encuentran esparcidas por toda la epidermis y gastrodermis de los tentáculos y región oral, donde se agrupan y forman verrugas, y fue en estas zonas donde nuestros ensayos mostraron tinción positiva (Figura 7 y 9) y faltan o son escasas en las regiones aborales, donde no se apreció positividad en ningún experimento.
La presencia de estas toxinas potentes en estas regiones, no es sorprendente si consideramos que las anémonas son animales sedentarios que necesitan armas altamente efectivas y de acción rápida capaz de movilizar y matar presas y/o repeler los posibles depredadores. Aquellas toxinas destinadas a la defensa y captura de presas deben ser secretadas por nematocitos por su eficiente mecanismo de descarga, que consiste en un cambio en la permeabilidad de la pared de la cápsula bajo influencia de factores mecánicos y químicos.30 En este sentido, parece razonable que estas citolisinas estén destinadas a inmovilizar y matar pequeñas presas; al respecto se ha demostrado que estas proteínas son altamente letales para crustáceos y peces.33 Por otra parte estas proteínas pudieran colaborar en la digestión de las presas, que según se ha demostrado, en estos organismos es llevada a cabo por enzimas similares a la tripsina y quimotripsina 110.
En relación con la función de defensa de estas proteínas, Senic y Mancek 111 encontraron evidencias de que ante una estimulación mecánica moderada, Actina cari
expulsa un líquido que contiene grandes cantidades de citolisinas. La toxina secretada puede tener una función de señal química para los depredadores, demás, debe ser una proteína constitutiva, garantizando una reserva permanente de la misma. En cuanto a nuestro caso, a pesar de ser los cnidocitos mas abundantes en la epidermis,30, 31 en todos nuestros ensayos se apreciaron mayor número de células teñidas en la gastrodermis.
Otra función que ha sido postulada para estas citolisinas, es su participación en la diseminación de las colonias de anémonas. En este caso se produce una competencia por el espacio a través de agresiones intraespecies. Las toxinas son secretadas una vez que se ha producido el contacto entre los tentáculos de las anémonas y esta agresión provoca el desplazamiento de una de las anémonas.63
CONCLUSIONES
1. Se logró la purificación de los anticuerpos anti-sticholisina I y II resultando la tecnología de inmovilización de la sticholisina II en la matriz cromatográfica empleada, un método de bajo rendimiento y eficiencia.
2. Se localizaron las sticholisinas en cnidocitos de tentáculos y boca de la anémona de mar (Stichodactyla helianthus).
3. Se estandarizó la técnica inmunohistoquímica para la localización de sticholisinas en Stichodactyla helianthus.
RECOMENDACIONES
1. Revisar las condiciones de aplicación y elución de la columna de inmunoafinidad teniendo en cuenta que un 42 % de eficiencia de acoplamiento no justifica tan bajos por cientos de purificación.
2. Mejorar el método de colecta de las anémonas con el propósito de disminuir la pérdida de toxinas por el estrés provocado.
3. Continuar el estudio inmunohistoquímico con mayor número de muestras, incluyendo anémonas de otras localidades.
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