Diseño experimental y preparación de las soluciones de ensayo

 Isópodos y anfípodos

Se llevaron a cabo tres bioensayos de tolerancia a 96 h en cada especie, exponiendo los organismos a diferentes condiciones ambientales en cuanto a salinidad, pH y concentración de amonio. El mismo diseño experimental fue aplicado en ambas especies para los 3 estresores.

Los experimentos consistieron en una serie creciente de concentraciones del estresor bajo sistema estático con renovación. Una vez al día se comprobó la supervivencia de los organismos en todos los tratamientos y se registraron la temperatura, la salinidad, la conductividad, el oxígeno disuelto y el pH en cada uno de ellos con una sonda multiparamétrica Horiba U-10®. Al inicio de cada ensayo (T0) se tomaron muestras de isópodos y de anfípodos como referencia de los parámetros iniciales. Al finalizar las 96 h de ensayo, se llevaron a cabo las mediciones fisiológicas de consumo de oxígeno y excreción nitrogenada. Posteriormente, los organismos fueron colectados, enjuagados en agua destilada, secados en papel absorbente y dispuestos en tubos eppendorfs que se conservaron a -20ºC por 24 h, paso previo necesario para la liofilización de las muestras. Este proceso extrae el contenido de agua mediante vacío y baja temperatura permitiendo el posterior análisis bioquímico de las muestras. Una vez liofilizadas se almacenaron en desecador hasta su posterior análisis bioquímico.

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El rango ensayado de los estresores salinidad, pH y amonio fue seleccionado teniendo en cuenta los valores determinados en la zona costera de la ciudad de Ushuaia, bajo los cuales los organismos podrían estar sometidos.

Particularmente para la salinidad, los valores ensayados estuvieron dentro del rango obtenido por Amin et al. (2011b) (3.2 a 32.1) teniendo en cuenta diversos puntos costeros, siendo la salinidad promedio de 24.55 (±6.63). Además, al estar los organismos presentes en zonas de descarga de cursos de agua dulce y de efluentes urbanos, podrían estar sujetos a una importante variación de este parámetro.

El pH es un parámetro que presenta menor variación a lo largo de los sitios costeros. Los valores disponibles en la literatura se encuentran dentro del rango 6.57 a 8.47 y promedian un valor de 7.62 (±0.41) (Amin et al., 2011b).

En cuanto a la concentración de amonio en la zona costera, los valores de referencia tomados en el presente estudio fueron extraídos de aquellos obtenidos en muestreos previos incluyendo sitios costeros y descargas sobre línea de costa. Dichos valores oscilaron entre 0.03 y 38.5 mg NH4+ L-1, siendo el valor del sitio control o de referencia (Playa Larga) de 0.06 mg NH4+ L-1.

 Salinidad

Los experimentos de tolerancia a variaciones en la salinidad se llevaron a cabo utilizando cinco salinidades: 5, 10, 15, 25 y 30. Los tratamientos 5, 10 y 15 se obtuvieron por dilución de agua de mar filtrada con agua destilada, mientras que los tratamientos 25 y 30 se lograron por concentración de agua de mar mediante evaporación. Para cada tratamiento se dispusieron en total 25 isópodos o 45 anfípodos en 3 L de agua de mar.

 pH

Los experimentos de tolerancia a diferentes niveles de pH se realizaron utilizando tres tratamientos: 6.9, 7.8 y 8.5. Estos valores se obtuvieron ajustando el pH del agua de mar filtrada (=7.65) con HCl o NaOH. En cada tratamiento se dispusieron 22 isópodos o 45 anfípodos en 3 L de agua al pH correspondiente.

98  Amonio

Los experimentos de tolerancia a diferentes concentraciones de amonio se realizaron utilizando seis concentraciones nominales (control de agua de mar, 5.5, 9.57, 16.66, y 29 mg NH4+ L-1) cuyos valores reales fueron 0.045, 3.10, 5.75, 10.41 y 17.12 mg N-NH3 L-1. Las concentraciones ensayadas se obtuvieron agregando en una serie de concentración logarítmica, una determinada cantidad del reactivo cloruro de amonio (NH4Cl) al agua de mar filtrada, excepto en el tratamiento control al cual no se le adicionó reactivo. La concentración de amonio en cada tratamiento se determinó mediante el método del indofenol descripto por Strickland & Parsons (1972). Las concentraciones medias de amonio se calcularon promediando los valores de amonio inicial, medio y final de los 4 días de ensayo para cada tratamiento (variación entre 6 y 13%; n=12). Finalmente, en cada recipiente de ensayo se dispusieron 25 isópodos o 45 anfípodos en 3 L de agua con la concentración de amonio correspondiente.

 Larvas de centolla

Se realizaron tres bioensayos de tolerancia con larvas de centolla, exponiendo los organismos a diferentes concentraciones de amonio.Los diferentes tiempos de exposición y los parámetros registrados en cada bioensayo se indican en la Tabla 26.

 Ensayo agudo a 96 h

Se realizó un bioensayo a 96 h utilizando una serie de concentraciones nominales de amonio de 10.10; 16.32; 27.20; 45.07; 73.82; 121.99 y 202.02 mg N-NH3 L-1 (equivalentes a 13; 21; 35; 58; 95; 157 y 260 mg NH4 L-1, respectivamente). Todas las concentraciones ensayadas se prepararon a partir de una solución madre de NH4Cl (1000 mg L-1) tomando las alícuotas correspondientes a cada una.

Se seleccionaron al azar larvas recién nacidas (zoeas I). Grupos de 10 organismos se colocaron en recipientes con 150 mL de solución. Cada tratamiento se realizó por triplicado, incluyendo un control de agua de mar filtrada (menos de 0.04 mg N-NH3 L-1) y se mantuvieron en el laboratorio climatizado a una temperatura de 8 ± 0.5ºC, cubiertas con papel semitransparente (para evitar la luz fluorescente en forma directa) y sin aireación. Diariamente se registraron las larvas muertas y las sobrevivientes se transfirieron a recipientes con medio fresco, de acuerdo al sistema estático con renovación diaria

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empleado. El criterio de muerte utilizado en este ensayo fue el cese del latido cardíaco observado bajo lupa (Rodríguez & Amin, 1991).

Se calculó el porcentaje de supervivencia de larvas en cada tratamiento y la concentración letal 50 (CL50) a 96 h y sus límites de confianza al 95% mediante el análisis Probit incluyendo la corrección de Abbott para la mortalidad del control (Finney, 1971).

 Ensayoagudo a 48 h

A partir de los resultados de mortalidad a 96 h, se seleccionaron 2 concentraciones subletales de amonio (20.20 y 40.40 mg N-NH3 L-1) para realizar un bioensayo de tolerancia a 48 h. Los tratamientos se prepararon con las correspondientes cantidades de NH4Cl, adicionando un control de agua de mar filtrada. Se seleccionaron larvas recién nacidas y se expusieron grupos de 140 organismos en recipientes con 350 mL por cada tratamiento ensayado.

Luego de las 48 h se registraron el consumo de oxígeno y la excreción nitrogenada como respuestas fisiológicas frente a la exposición a amonio. La metodología utilizada se describirá en la sección 3.2 (página 101).

 Ensayoscrónicos hasta muda al estadio postlarva

Para evaluar la toxicidad crónica en las larvas de centolla, se realizaron dos bioensayos siguiendo la misma metodología descripta para el ensayo agudo a 96 h, es decir, se utilizaron las mismas 8 concentraciones de amonio (control, 10.10; 16.32; 27.20; 45.07; 73.82; 121.99 y 202.02 mg N-NH3 L-1) e idéntico diseño experimental. Zoeas I permanecieron expuestas a las diferentes concentraciones de amonio durante el desarrollo larval hasta alcanzar el estado postlarval de megalopa. Las larvas ensayadas provinieron de dos eclosiones masivas diferentes (EI y EII, respectivamente) para poder evaluar al mismo tiempo la variación de respuesta entre las mismas.

Diariamente se registró la supervivencia y se determinó bajo lupa el estadio larval en el cual se encontraba cada organismo. Las larvas que mudaban de estadio, fueron transferidas a nuevos recipientes agrupando a todas aquellas mudadas simultáneamente y sometidas a idéntico tratamiento para continuar con el seguimiento diario de muda. Se calculó el tiempo medio de vida (TV50) que es el tiempo en el cual el 50% de las larvas ensayadas muere y fue estimado para cada tratamiento mediante el análisis Probit. También

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se calculó el tiempo medio de muda (TM50) que es el tiempo en el cual el 50% de las larvas ensayadas mudan de un estadio al siguiente y fue estimado para cada cambio de estadio (zoea I a II, II a III y III a postlarva) y para cada tratamiento mediante el análisis Probit (Finney, 1971). Por último, se estimaron el porcentaje acumulado de muda como la proporción de larvas mudadas de un estadio al siguiente respecto al número total de larvas en cada tratamiento (zoea I a II, II a III y III a postlarva) y elporcentaje total de muda como la proporción de larvas mudadas del estadio zoea I al postlarval de megalopa.

3. Medición de biomarcadores