Disolventes y purificación de los mismos.

Los disolventes utilizados en las extracciones y análisis de muestras por HPLC fueron éter etflico (“Probus”, “Panreac”), cloroformo (“Panreac”). butanol (“Merck”). hexano (“Merck”), acetonitrilo (“Carlo Erba”), tetrahidrofurano (“Baker”) y metanol (“Carlo Erba”). Aquellos utilizados como disolventes en la cromatografía líquida (acetonitrilo, tetrahidrofurano y metanol) eran de calidad HPLC..

El cloroformo se purificó en el laboratorio por destilación fraccionada con una columna de rectificación de Vigreux, eliminando las fracciones de “cabeza” y “cola”..

El éter etílico se liberó de peróxidos antes de su uso, destilándolo sobre polvo de hierro reducido.

Materialesymétodos

11.3. METODOLOGíA.

11.3.1.. Determinación de la actividad de las proteasas.

Las enzimas empleadas en las experiencias quese describen en el presente trabajo fueron las siguientes:

- Proteasa purificada tipo XIV de Srreptomyces griseus (PronasaE).

- Proteinasa cruda tipo LI de Aspergillus oryzae (Aspartil proteinasa ácida)..

- Papaína cruda tipo II de Carica papaya, purificada del látex de papaya.

Todas ellas fueron suministradas por la firma ‘Sigma”.

La determinación de la actividad dc lgs enzimas comerciales empleadas se realizó a partir de una solución inicial de dichas enzimas con una concentración de 0,2 mg/ml en tampón TRIS-HCl, pH 6,5, con la que se realizaron diluciones decimales.

El sustrato empleado fue una solución de azocaseina (Sigma) al 0,8% en tampón TRIS-HCI 0,2 M. pH 6,5.. La reacción se realizó mezclando un volumen (1 mI) de cada dilución de las tres enzimas y otro del susuato. Seguidamente se incubaron a 37 0C durante 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos. Asimismo, se preparó un blanco al que se le añadió tampón en lugar de la enzima.. Transcurrido el tiempo correspondiente, la reacción se detuvo añadiendo a cadatubo 1 ml de una disolución de ácido tricloroacético al 6%.. A continuación, la mezcla se filtró a través de papel Whatman n~ 42. Finalmente se midió la absorbancia del filtrado a 440 nm.

Se definió como unidad de actividad enzimática a la cantidad de enzima que produce un aumento de 1 unidad de absorbancia a 440 nm en 1 hora a 370C utilizando como sustrato

U U—U.—.——. U U U 51.. U u 1.1 :: U ¡EL 1~

Mareflales y métodos

11.3.1.1.. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA PRONASA E EN DIFERENTES

CONDICIONES

Para la prueba de actividad con distintos valores de pH se prepararon varias

soluciones de concentración 4 j.±g/mlde pronasa E en tampón TRIS-HCl a pH 5,0, 5,5, 5,8 y 6,0, todos ellos cercanos a los alcanzados por los embutidos con pronasa E.. El sustrato empleado fue una solución de azocaseina (Sigma) al 0,8% en tampón TRI-HCI 0,2M con los mismos valores de pH que los de las soluciones de proteinasa. La reacción se realizó mezclando 1 volumen (lrnl) de cada solución de pronasa Econ otro de la soluicón de sustrato con el pH correspondiente. Seguidamente se incubaron a 250C durante 60 minutos, preparando además un blanco al que se le añadió tampón en lugar de la enzima.. Transcurrido el tiempo, la reacción se detuvo añadiendo a cada tubo 1 ml de una disolución de ácido tricloroacético al 6%. Después la mezcla se filtró a través de papel Whatman n2 42 y se midió la absorbancia del filtrado a 440 nm.

La prueba de la actividad de la pronasa E a distintas temperaturas se efectuó de igual forma pero utilizando soluciones de enzima y sustrato a pH 5,0 y 7,0, e incubándolas a 5, 10, 15 y 250C durante 60 minutos.

11.3.2. Preparación de las muestras..

11.3.2..!.FABRICACION DE LOS EMBUTIDOS..

La fabricación de los embutidos se realizó en una planta piloto localizada en una industria local. Se partió en todos los casos de una porción de la masa preparada por dicha industria y empleada en la elaboración de productos comerciales. Para ello, se separó de la cadena de producción la cantidad necesaria de dicha pasta.. Su composición

(%

Materialesymétodos

Carne magra de cerdo 56

Carne magra de vaca 12

Tocino 25

Dextrosa 0,8

Lactosa 1,0

Dextrina 1,8

Sal 2,5

Glutamato sódico y/o potásico 0,25 Nitrato sádico y/o potásico 0,0085 Nitrito sódico y/o potásico 0,0065

Pimienta negra molida 0,14

Ascorbato 0,046

Tanto la carne de cerdo y vacuno como el tocino procedían de producto previamente congelado. Posteriormente se picaron por separado a temperatura de refrigeración, hasta obtener un tamaño de partícula de 5 mm aproximadamente. A continuación se añadió el resto de ingredientes a la carne picada y todo ello se mezcló después con el tocino en una amasadora. La pasta así obtenida permaneció 48 horas en refrigeración. Previamente a su embutición, se añadieron las cantidades programadas de cada una de las proteasas objeto de estudio. Después se amasó en una mezcladora paraconseguir un reparto homogéneo..

Se realizaron 4 experiencias:

Se añadieron a los embutidos dos concentraciones de pronasa E de Srrepromyces

griseta 600 unidades enzimáticas/kg salchichón (la unidad ha quedado definida en 11.3.1) y

6000 unidades/kg salchichón. Al lote control no se le añadió enzima.

Se prepararon embutidos con dos dosis distintas de aspartil proteinasa de Aspergillus

oryzae. Se elaboraron tres lotes: el control, otro con 800 unidades enzimáticas/kg salchichón

y el tercero con 4500 unidades/kg salchichón..

*Eap~jcn~

Se añadieron a los embutidos dos concentraciones diferentes de papaína, procedente de

Carica papaya: 800 unidades/kg salchichón y 4500 unidades/kg salchichón. Igualmente se

Maeriales y métodos

Se añadió a la masa antes de embutir la concentración de cada una de las proteinasas anteriores que, de acuerdo con los resultados, se consideró más adecuada. Estas fueron 300 unidades/kg salchichón de pronasa E, 100 unidades/kg salchichón de aspartil proteinasa y 500 unidades/kg salchichón de papaína. El lote control no contenía enzima.

Previamente a su adición a la masa, las proteinasas se disolvieron en 100-200 ml de

agua destilada a fin de conseguir un reparto más homogéneo, a excepción de la papaína, que se disolvió en un volumen igual de tampón fosfato 0,lM y pH 6,6. A todos los lotes controles se les añadió un volumen igual de agua destilada para que su contenido inicial de humedad fuera lo más parecido posible.

Seguidamente, la masa de cada uno de los lotes se embutió en tripa artificial de

colágeno, obteniéndose piezas de 40 mm de diámetro y 15 cm de longitud, con un peso aproximado de 200g, obteniéndose un peso total por lote de alrededor de 5 kg. Inmediatamente se transportaron a una cámara climática “Kowell” mod. CC3 1 equipada con

un registrador “Sekonic” mod. SD-H50 a temperatura, humedad y velocidad de aire controladas, en la cual se realizó el proceso de maduración..