Diversidad catabólica: perfiles fisiológicos

La obtención rápida de perfiles multivariados basada en caracteres fisiológicos (Community Level Physiological Profiles o CLPP, también conocida como metabolic fingerprinting) se desarrolló originalmente en 1991 para comparar las comunidades bacterianas heterotróficas del suelo utilizando el sistema de medición Biolog (Garland y Mills, 1991). A partir de allí, se ha utilizado ampliamente para estudiar la diversidad funcional microbiana en una variedad de ambientes terrestres entre ellos compost (Insam et al., 1996), suelos agrícolas y suelos forestales bajo diferentes manejos (Busse et al., 2001; Gómez et al., 2004; Winding y Hendriksen, 2007) como así también en suelos expuestos a herbicidas (Zabaloy et al., 2008b). Una de las razones por las cuales los perfiles CLPP se han utilizado ampliamente para el estudio de comunidades microbianas es su sensibilidad, reproducibilidad y la capacidad de responder diferencialmente a diferentes sistemas de labranza (Govaerts et al., 2007), suelos contaminados (Boivin et al., 2002), rizosfera (Soderberg et al., 2004) y diferentes prácticas de manejo del suelo (Mäder et al., 2002).

El sistema Biolog es un sistema redox y dependiente del cultivo de microorganismos que consiste en una microplaca de 96 pocillos con diferentes sustratos carbonados y un indicador redox incoloro en cada uno de ellos. El desarrollo del color se mide espectrofotométricamente (absorbancia). A pesar de su extendida utilización, el método posee varios inconvenientes que han desalentado su uso y el reemplazo por otros métodos como los biosensores de oxígeno que se presentan a continuación. La principal desventaja radica en el hecho de que es dependiente de cultivo, pueden ocurrir cambios en la comunidad microbiana durante la incubación debido al enriquecimiento selectivo (Smalla et al., 1998) y la contribución de los hongos a la respiración de la comunidad no es incluida debido a su lento crecimiento (Nannipieri et al., 2003).

Un sistema más reciente que permite superar estas dificultades es el desarrollado por Wodnicka et al. (2000), ampliamente utilizado a lo largo de esta Tesis y en diversos estudios de ecología microbiana para la obtención de perfiles fisiológicos. Este sistema no depende de un indicador redox sino que consiste en la utilización de microplacas de 96 pocillos que contienen un fluoróforo sensible al oxígeno, de modo tal de monitorear el oxígeno consumido durante la respiración mediante mediciones de fluorescencia. El sistema comercializado por BD Biosciences (Bedford, MA, USA), conocido como BD Oxygen

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Biosensor System (BDOBS), posee un fluoróforo sensible al oxígeno, cloruro de 4,7-difenil- 1,10-fenantrolina rutenio (II), absorbido en una matriz siliconada permeable al oxígeno presente en la parte inferior del pocillo. La fluorescencia de este compuesto es extinguida por la presencia de oxígeno y en consecuencia se incrementa a medida que la respiración microbiana en la suspensión de suelo consume el oxígeno disponible. Dado que la matriz con el fluoróforo es el único componente de las placas, ciertos factores como la disponibilidad de nutrientes o factores fisicoquímicos pueden ser manipulados en el ensayo. Al mismo tiempo, dado que dicha matriz se encuentra ubicada en la parte inferior y la medición se basa en fluorescencia (no en absorbancia), es posible evaluar materiales turbios u opacos con equipos de lectura desde la parte inferior de la microplaca. Mediante este sistema de medición, Garland et al. (2003) reportaron la utilización de concentraciones muy bajas de sustrato (50-100 mg l-1) que representan valores entre 10-100 veces menores a los requeridos en CLPP con el sistema Biolog. Asimismo, Garland et al. (2003) encontraron que la cinética de la respuesta fluorescente se correlaciona con medidas in situ

de uso de los sustratos, indicando que la metodología BDOBS-CLPP produce perfiles funcionalmente relevantes a diferencia de Biolog-CLPP. El requerimiento de cantidades de sustratos entre 10-100 veces menor que en otras metodologías de CLPP permite superar las dificultades relacionadas con el enriquecimiento selectivo. La cuantificación del oxígeno consumido permite una mayor sensibilidad (utilización de menores concentraciones de sustrato) debido a que es casi 30 veces menos soluble que el dióxido de carbono (Bugbee

et al., 2008; Zabaloy et al., 2008). Asimismo, la medición de la respiración basada en el consumo de oxígeno no se ve afectada por factores que influyen sobre la evolución del dióxido de carbono. El flujo de dióxido de carbono en la superficie del suelo es una medida indirecta de respiración que supone que todo el flujo es resultado de la respiración, lo cual es válido sólo en un corto período de tiempo. Existen múltiples factores que podrían contribuir significativamente al flujo de dióxido de carbono en la superficie del suelo y que deben ser considerados para estimar adecuadamente las tasas de respiración. La concentración de dióxido de carbono en los gases del suelo y el flujo a la superficie varían con la temperatura, el contenido de agua y el pH dado que estas variables fisicoquímicas influyen en su solubilidad y en su equilibrio con carbonatos (Bugbee, 2008).

El sistema BDOBS ha sido estudiado y optimizado por Zabaloy et al. (2008a). De acuerdo con los resultados de esta investigación, la utilización de volúmenes cercanos a la capacidad máxima del pocillo permiten discernir tanto la respuesta a una concentración de sustrato tan baja como 10 mg l-1, como también la respiración endógena (sin sustrato). Se ha sugerido incluso que no es necesario el sellado de la placa como barrera al oxígeno

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cuando se utilizan volúmenes grandes en los pocillos. También se determinó que la disrupción de las muestras mediante preparación de suspensiones de suelo no tiene efectos en la respuesta fluorescente global cuando se compara con la utilización de muestras encerradas en microbolsas. Diversos trabajos han demostrado la aplicabilidad y las ventajas de utilización de placas BDOBS en mediciones de respiración de comunidades microbianas del suelo (Garland et al., 2003; Zabaloy et al., 2008; Zabaloy et al., 2012).