0 5 10 15 20 25 30 35 40
Gram Negativos Gram Positivos Hongos Actinos Gram Negativos Y gram Positivos Nu m e ro M icr oo rg a n im os
Diversidad Microorganismos en las muestras
M1 Y M2
Metodologia Tradicional
BioCebos C1
BioCebos C2
41
Imagen 3: Desorción de microorganismos en medio T2 semisolido con BioCebos de GAC microporoso C1
Imagen 4: Desorción de microorganismos en medio T2 semisolido con BioCebos de GAC mesoporoso C2
42
Imagen 5: Desorción de microorganismos en medio T2 semisolido con BioCebos de GAC macroporoso C3
43
8. DISCUSIÓN
8.1 EVALUACIÓN DE LA TÉCNICA DE DESPRENDIMIENTO DE
BIOMASA DE CA POR SONICACIÓN
Con respecto a los resultados obtenidos a partir de los análisis estadísticos se puede determinas que únicamente la variable morfotipos contrasta la hipótesis nula, y afirma que por lo menos uno de los tratamientos tiene diferencias significativas sobre la recuperación de morfotipos. Con respecto a los niveles de significancia (sig= 0.058) del tratamiento T3, a las pruebas de significación y a los coeficientes Beta (tabla 9), que determinan que variables tienen mas peso o importancia sobre el estudio, se podría establecer que el tratamiento T3 por ciclos puede dar mejores resultados cuando se busca recuperar la mayor cantidad de morfotipos. Es importante resaltar que, en ambos análisis estadísticos donde las variables dependientes eran: morfotipos y UFC/ml, el tratamiento 1 fue omitido por el programa estadístico, ya que probablemente los datos eran poco o nada importantes dentro de la nube de puntos en el hiperplano.
Algunos autores que han profundizado en el tema de desprendimiento de biomasa a partir de diferentes superficies, han determinado que altos tiempos de sonicación (30min-40 kHz) son favorables para algunos tipos de Biopeliculas (55), y más aun, si se combinan con vortex (10 min- 38.5 to 40.5 kHz) (56), esto demuestra que T4 (3min vortex- 5min sonicación-2min vortex) podría ser un buen tratamiento. No obstante, el sonicador que se manejo durante este experimento, no cuenta con control de amplitud, frecuencia, ni temperatura; parámetros que puedieron influir fuertemente en los resultados estadísticos (57).
Sin embargo, en 2001, Donlan y colaboradores, corroboraron, que al utilizar ciclos de 30s - 42 kHz, seguidos de 30s de vortex; se recuperaba cerca del 97% de células adheridas a partículas plásticas (58). Si bien la metodología T3 (sonicación y vortex por ciclos) fue estadísticamente significativa con respecto a los demás tratamientos, es evidente que existen otros factores que pueden interferir en el análisis: como lo son, el suelo (sig=0.000) y en menor medida el tipo de poro del carbón activado (sig=0.250), sin emabrgo, se piensa que no son determinantes de viabilidad celular. Este parámetro es uno de los aspectos de mayor importancia en la decisión del mejor tratamiento para el desprendimiento celular (57).
8.2 EVALUACIÓN DE BIOBAITS DE CARBÓN ACTIVADO
El efecto de la adsorción según la estructura del poro y el área superficial, deben ser consideradas según la química natural del CA. Se sabe que, inicialmente, cuando el TNT se difunde dentro de la superficie interna del CA con macroporos, podría atravesar libremente y no interactuar con la superficies reactivas; mientras que en un mesoporo, se podrían llevar a cabo algunas interacciones entre los grupos reactivos de CA (los
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grupos funcionales libres, resultado del proceso de activación) y del explosivo (grupos nitro). Lo que no ocurre, cuando este tipo de molécula se difunde en un microporo, en donde, puede quedar parcialmente restringida su movilidad por la estreches del poro (59).
En este sentido, se podría decir, que los BioCebos mesoporosos y macroporosos (C2 y C3 respectivamente) podrían no interactuar adecuadamente con las moléculas de TNT, pues la estructura del poro, dificultaría la interacción de la Pentolita con las partes reactivas de la superficie del carbón, y por ende la adsorción del explosivo en la construcción del BioCebo; mientras, que los BioCebos microporosos incrementarían la adsorción del compuesto. No obstante, es preciso aclarar, que este estudio no llevo a cabo un proceso de difusión del explosivo para ser adsorbido, sino que por el contrario, los CA se sometieron a saturación estable, en donde se favorece la disminución de la concentración del soluto en el solvente y por ende también la capacidad de adsorción, debido a la saturación de la superficie interna (60). Por este motivo, el tipo de afirmaciones mencionadas anteriormente de acuerdo a la adsorción del explosivo puede variar para este caso, gracias al tiempo de interacción estable entre la superficie del carbón activado con la Pentolita.
Finalmente, es de gran importancia discutir el proceso Bioabsorción que se llevo a cabo en los BioCebos. La unión de bacterias al carbón activado, se debe a tres factores importantes: 1) a las propiedades adsortivas del carbón, que puede producir una incremento en la concentración de nutrientes y oxigeno; 2) la estructura del poro, que provee a la bacteria un ambiente protegido contra fuerzas de arrastre o fluido constante; 3) la presencia de una larga variedad de grupos funcionales en la superficie del carbón activado (33), siendo esta la que podría generar mas interés dentro del estudio. Si bien fuera cierto, que el carbón microporoso retiene en alta concentración el explosivo, y que por el contrario, los carbonos macro y microporoso, no tuvieran la tendencia a la saturación; esto permitiría una mayor disponibilidad de espacio y de grupos funcionales para la creación de conglomerados celulares, sin contar con una mayor disposición de oxigeno.
Ahora bien, si se consideran todos los parámetros anteriormente nombrados, con la eficiencia (tiempo* materia prima*mano de obra) del método, podríamos concluir que a pesar de que los microorganismos aislados a partir del carbón microporoso C1, puedan tener una mayor interacción con el explosivo, debido a la saturación del poro; no es una alternativa del todo efectiva en cuanto a tiempo y mano de obra, ya que debido al tamaño tan pequeño de partícula, estos factores incrementan, mientras que disminuye la posibilidad de recuperar toda la materia prima involucrada en un principio. Lo cual no sucede con los carbonos macro y mesoporoso, en los cuales la eficiencia es mucho mayor, ya que la recuperación desde el suelo, no es tan sumamente dispendiosa como la del C1.
45
Finalmente, aunque C2 y C3 están en un rango equitativo en cuanto a recuperación de morfotipos, el carbono mesoporoso C2, puede tomarse como la mejor alternativa dentro de los BioBaits de CA, porque brindan una recuperación de biomasa en un rango intermedio, una posible mejor adsorción del explosivo en relación al poro, y una alta recuperación de morfotipos; sin contar, con el tiempo intermedio de recuperación de los microcosmos.
8.3 EVALUACIÓN DEL MÉTODO TRADICIONAL Vs. BIOBAITS
Como se evidencio en el grafico 6, existen diferencias entre el número de morfotipos recuperados en cada metodología evaluada. Aunque el tratamiento tradicional, es ampliamente aplicado, debido a su eficiencia, en el incremento de la población de interés y a la facilidad de su desarrollo en el laboratorio; muestra que pese a que es un método eficiente, no necesariamente recupera toda la población de interés (grafico 7). Es posible que los microorganismos aislados con BioCebos tengan ventajas competitivas interesantes, ya que no se les brindo nutrientes para favorecer el incremento de su población, sino que por el contrario, se les sometió a presión selectiva dentro de su propio medio natural (simulando un efecto de contaminación ambiental en donde el contaminante estaba adsorbido a una superficie).
Entre algunas de las ventajas selectivas que podrían tener estos microorganismos se encuentran: enzimas catabólicas especificas o inespecíficas con las que pueda usar la el compuesto, una superficie celular que promueva la adhesión a superficies hidrofóbicas o alguna otra característica que incremente la biodisponibilidad (13) y desabsorción del contaminante (como cambios de pH, cosolventes orgánicos o producción de sustancias surfactantes) (41).
Es importante tener en cuenta que los microorganismos que lograron establecerse sobre la superficie del explosivo, posiblemente sean de mayor relevancia, ya que existen reportes basados en el crecimiento de biopeliculas sobre superficies cristalinas de sustancias contaminantes, como el pireno o el fenantreno (61), que reportan mineralización o una alta eficiencia en la degradación de los mismos. De esta manera se podría concluir que los BioCebos son una alternativa viable para el asilamiento de microorganismos degradadores de Pentolita y a la vez, puede ser complementaria al método tradicional de enriquecimiento, puesto que no existieron muchas similitudes entre los morfotipos de un método y el otro.
46
9. CONCLUSIONES
o
Aunque no se observe un efecto marcadamente significativo en los tratamientos de desprendimiento de biomasa por sonicación, la decisión de utilizar el tratamiento por ciclos T3, que mostraba los mejores resultados en cuanto a la recuperación de morfotipos, funciono adecuadamente para el estudio.o
La nueva alternativa de aislamiento de microorganismos potencialmente degradadores de Pentolita con BioCebos, demostró que es mucho mas eficiente que la metodología tradicional por enriquecimiento, según el numero de morfotipos recuperados y la diversidad microscópica encontrada; sin embargo, pueden ser complementarias entre si.o
Los BioCebos de carbón activado mesoporoso (C2) y macroporoso (C3), mostraron excelentes resultados en cuanto la numero de morfotipos aislados. No obstante, el carbono mesoporoso C2, puede tomarse como la mejor alternativa dentro de los BioCebos de CA, porque brinda una recuperación de biomasa (UFC/ml) en un rango intermedio, y una adecuada diversidad microscopica.o
El explosivo solido mostro que existe la posibilidad de que diferentes microorganismos crezcan sobre la superficie de la pentolita, cuando esta actúa como única fuente de nitrógeno en un medio semisólido, por lo cual, estos microorganismos puede tener características ventajosas y relevantes sobre otros.47
10.
RECOMENDACIONES
o
Es importante que durante el periodo de incubación en microcosmos con BioBaits, se mantengan muy presente la capacidad de campo de campo para cada tipo de suelo; con ello se disminuyen posibles “sesgos” a causa de la desecación o saturación del suelo.o
Se hace necesario evaluar a fondo el método de extracción de la pentolita a los GAC, para poder cuantificar la cantidad de explosivo retenido por un BioBait.o
Seria interesante comprobar a partir de otros ensayos (con suelos lodosos y secos), si la metodología tradicional evidentemente recupera mayor numero de morfotipos, desde suelos saturados que desde suelos no saturados.48
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53
ANEXOS
ANEXO 1: INFORME DE RECUENTO PARA CADA TIPO DE MUESTRA DE ACUERDO A LA EVALUACION DE LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS EVALUADOS
INFORME DE RECUENTO PARA LA MUESTRA DE CAMPO DE PRUEBA (M1)
1E-01 1E-02 1E-03 1E-04 1E-05
C1P1 > 10E2 > 10E3 > 10E4 3*10E7 5*10E8
C1P2 >10E2 > 10E3 3*10E6 C.E 4*10E7 3*10E8
C1P3 >10E2 > 10E3 > 10E4 4*10E7 ND
C1P4 >10E2 > 10E3 > 10E4 3*10E7 3*10E7
C2P1 >10E2 > 10E3 > 10E4 4*10E7 2*10E8
C2P2 >10E2 2*10E5 1*10E7 6*10E7 2*10E8
C2P3 >10E2 > 10E3 ND 6*10E7 2*10E8
C2P4 >10E2 > 10E3 > 10E4 ND 1*10E8
C3P1 >10E2 > 10E3 > 10E4 4*10E7 2*10E8
C3P2 >10E2 > 10E3 > 10E4 6*10E7 1*10E8
C3P2 >10E2 > 10E3 > 10E4 5*10E7 1*10E8
C3P4 >10E2 ND > 10E4 4*10E7 8*10E7
INFORME DE RECUENTO PARA LA MUESTRA DE FITORREMEDIACIÓN (M2)
1E-02 1E-03 1E-04 1E-05 1E-06
C1P1 1*10E5 3*10E5 7*10E5 3*10E6 <10E7
C1P2 2*10E5 7*10E5 7*10E5 1*10E6 <10E7
C1P3 2*10E5 2*10E5 5*10E5 2*10E6 1*10E7
C1P4 3*10E5 6*10E5 2*10E6 7*10E6 1*10E7
C2P1 >10E3 > 10E4 1*10E7 7*10E6 1*10E7
C2P2 >10E3 1*10E5 1*10E6 2*10E6 1*10E7
C2P3 >10E3 7*10E5 >10E5 5*10E7 1*10E7
C2P4 >10E3 1*10E6 1*10E6 2*10E6 2*10E7
C3P1 7*10E4 2*10E5 2*10E5 1*10E6 <10E7
C3P2 5*10E4 4*10E5 9*10E5 1*10E6 1*10E7
C3P2 2*10E4 1*10E5 3*10E5 1*10E6 <10E7
C3P4 6*10E4 4*10E5 8*10E5 1*10E6 <10E7
INFORME DE RECUENTO PARA LA MUESTRA EXTERIOR DE LA PLANTA (M3)
1E-02 1E-03 1E-04 1E-05 1E-06
C1P1 1*10E6 C.E 2*10E6 9*10E5 1*10E6 1*10E7
C1P2 >10E3 1*10E6 5*10E6 5*10E6 <10E7
C1P3 >10E3 > 10E4 2*10E7 C.E 5*10E6 <10E7
C1P4 >10E3 4*10E6 C.E 1*10E7 2*10E6 <10E7
C2P1 >10E3 > 10E4 2*10E7 9*10E6 1*10E7
54
C2P3 >10E3 > 10E4 2*10E7 4*10E7 1*10E8
C2P4 >10E3 > 10E4 1*10E8 C.E 4*10E7 7*10E7
C3P1 >10E3 1*10E7 C.E 2*10E7 3*10E7 >10E7
C3P2 >10E3 > 10E4 7*10E7 C.E 5*10E7 2*10E7
C3P2 >10E3 > 10E4 7*10E7 C.E 6*10E7 6*10E7
C3P4 >10E3 > 10E4 8*10E7 C.E 8*10E7 >10E7
ANEXO 2: NUMERO DE MORFOTIPOS AISLADO DE CADA MUESTRA DE SUELO POR CADA TRATAMIENTO DE SONICACION EVALUADO
M1 CAMPO DE
PRUEBA
Tratamiento Nº Morfotipos
CA Microporoso
C1
P1
4
P2
8
P3
2
P4
12
P1
7
CA Mesoporoso
C2
P2
4
P3
9
P4
3
CA Macroporoso
C3
P1
4
P2
6
P3
7
P4
5
M2
FITORREMEDIACION
Tratamiento
Nº Morfotipos
CA Microporoso
C1
P1
8
P2
14
P3
16
P4
16
CA Mesoporoso
C2
P1
12
P2
14
P3
15
P4
10
CA Macroporoso
C3
P1
15
P2
16
P3
17
P4
13
55
M3 EXTERIOR
PLANTA
Tratamiento
Nº Morfotipos
CA Microporoso
C1
P1
15
P2
17
P3
21
P4
15
CA Mesoporoso
C2
P1
12
P2
8
P3
19
P4
16
CA Macroporoso
C3
P1
12
P2
7
P3
14
P4
10
56
ANEXO 3:COLONIAS RECUPERADAS EN AGAR NUTRITIVO A PARTIR DE LA EVALUACIÓN
DE TRES TRATAMIENTOS DE SONICACIÓN PARA LA MUESTRA 1:CAMPO DE PRUEBA
Carbón
Activado Tratamiento
Foto
Caracterización Macroscópica
C1
P1
Colonia convexa, borde ondulado, de consistencia viscosa y forma circular
alargada, centro naranja y borde blanco.
Colonia convexa, borde entero, de consistencia viscosa y forma circular,
color naranja.
Colonia plana, borde ondulado, de consistencia friable y forma irregular,
color blanco.
Colonia plana, borde ondulado, de consistencia mucosa y forma circular,
color blanco.
C1
P3
Colonia umbeliforme, borde ondulado, de consistencia mucosa y color
amarillo opaco.
Colonia umbeliforme, borde blanco aserrado, de consistencia viscosa y
color naranja claro.
C1
P4
Colonia convexa, borde entero, de consistencia mucosa y forma circular,
color naranja claro.
Colonia plana, borde lobulado, de consistencia friable y color blanco.
Colonia plana, borde ondulado, de consistencia mucosa y color curuba
claro
Colonia plana, borde lobulado, de consistencia viscosa y color blanco
57
ANEXO 3:COLONIAS RECUPERADAS EN AGAR NUTRITIVO A PARTIR DE LA EVALUACIÓN
DE TRES TRATAMIENTOS DE SONICACIÓN PARA LA MUESTRA 1:CAMPO DE PRUEBA
Carbón
Activado Tratamiento
Foto
Caracterización Macroscópica
C1
P4
Colonia umbeliforme, borde ondulado, de consistencia friable y forma circular,