3. LA PROTEÍNA QUINASA C
3.2. Dominios conservados de las PKCs
3.2.2. Dominio C1
Las isoenzimas clásicas y nuevas de la PKC contienen un dominio C1 que contiene aproximadamente unos 50 residuos y se define por la presencia de dos motivos de dedos de zinc, llamados C1a y C1b (Parker y col., 1986). Cada uno de estos dedos de zinc se caracteriza por presentar un patrón conservado de residuos de Cys e His (HX12CX2CX13/14CX2CX4HX2CX2CX7C), el cual es el responsable de la
coordinación de dos iones Zn2+ (Hubbard y col., 1991; Quest y col., 1992). Mediante estudios de RMN y de difracción de rayos X se ha podido determinar la estructura tridimensional de estos motivos C1 (Hommel y col., 1994; Zhang y col., 1995) y se
Posición Sustrato óptimo
R R R R R K G SSSS F R R K A
PseudosustratoN R F A R K G A L R Q K N
Sustrato óptimoA R R K R K G SSSS F F Y G G
PseudosustratoP T M N R R G A I K Q A K
PKCα
PKCδ
PKCζ
Sustrato óptimoR R F K R Q G SSSS F F Y F F
PseudosustratoK S I Y R R G A R R W R K
-7 -6 -5 - 4 - 3 - 2 - 1 0 + 1 + 2 + 3 + 4 + 5 Isoenzima Posición Sustrato óptimoR R R R R K G SSSS F R R K A
PseudosustratoN R F A R K G A L R Q K N
Sustrato óptimoA R R K R K G SSSS F F Y G G
PseudosustratoP T M N R R G A I K Q A K
PKCα
PKCδ
PKCζ
Sustrato óptimoR R F K R Q G SSSS F F Y F F
PseudosustratoK S I Y R R G A R R W R K
-7 -6 -5 - 4 - 3 - 2 - 1 0 + 1 + 2 + 3 + 4 + 5 Isoenzimaha observado que presentan una estructura globular formada por dos hojas β antiparalelas, con tres y dos cadenas respectivamente, y una pequeña hélice α en el extremo carboxilo terminal (Figura I.8). Los átomos de Zn2+ se localizan al final de cada una de las hojas β, en los extremos opuestos del dominio, donde están coordinados por los residuos conservados de His y ayudan a estabilizar la estructura globular del dominio. La estructura del dominio C1 es similar a la de los dedos de zinc de ciertas proteínas responsables del enlace a ADN para la regulación transcripcional (Berg, 1990), a pesar de que parece ser que la PKC no se une a ADN de forma habitual (Testori y col., 1988)
Figura I.8. Estructura del dominio C1b de la PKCδδδδ. Se muestra la estructura tridimensional del dominio C1b de la PKCδ unido a PMA (Zhang y col., 1995). La molécula de PMA se encontraría inmersa en la membrana. Los átomos de zinc se representan en rosa en ambos lados de las hojas β.
Inicialmente, mediante diferentes estudios de mutagénesis y deleción de aminoácidos, se propuso que el dominio C1 era el sitio de unión de ésteres de forbol (Kaibuchi y col., 1989; Ono y col., 1989), lo cual se confirmó posteriormente con la resolución de la estructura tridimensional del motivo C1b de la PKCδ complejado con PMA (Zhang y col., 1995). Además, diversos estudios de unión a ligandos mostraron que el DAG compite con los ésteres de forbol por el enlace a la PKC
(Sharkey y Blumberg, 1985). El 12-miristato-13-acetato (PMA) se une a una cavidad formada por el acoplamiento de las dos hojas β que componen el dominio (Newton, 1997). La unión de este éster de forbol no supone grandes cambios conformacionales en el dominio C1b e incluso parece ser que el ligando bloquea una zona hidrofílica en la parte superior del dominio, de modo que se forma así una región hidrofóbica en la superficie del mismo que permite su anclaje a la membrana (Zhang y col., 1995).
A pesar de que las isoenzimas clásicas y nuevas de la PKC poseen dos motivos C1, numerosos estudios han demostrado que la estequiometría de la unión de éster de forbol a la PKC es 1:1 (Kikkawa y col., 1983; König y col., 1985; Hannun y Bell, 1986; Mosior y Newton, 1996), lo cual sugiere que la función proteica está regulada por uno solo de los dominios C1.
Estudios recientes con dominios C1a y C1b sintetizados in vitro de todas las isoenzimas de la PKC, han puesto de manifiesto que los dominios C1b muestran afinidades mayores por el éster de forbol 12,13-dibutirato (PDBu) que los dominios C1a (Irie y col., 1998). Esta idea está de acuerdo con estudios previos de mutagénesis que demostraron que los dos dominios C1 de la PKCδ (C1a y C1b) no son equivalentes y parece ser que el dominio C1b es el principal responsable de la unión de DAG y ésteres de forbol. En concreto, la mutación de un residuo conservado de Pro en el dominio C1b de la PKCδ provoca la pérdida de afinidad por ésteres de forbol, mientras que la mutación del residuo equivalente en el dominio C1a tiene un efecto muy pequeño (Szallasi y col., 1996). En cambio, estas hipótesis no son aplicables al resto de dominios C1 de la PKC y así, los dominios C1 de la PKCγ tienen afinidades similares (Burns y Bell, 1991; Irie y col., 1998), mientras que en el caso de la PKCα, el dominio C1a es el esencial para la unión de ligando y activación de la enzima y el dominio C1b no está implicado en estos procesos (Medkova y Cho, 1999). Otros experimentos llevados a cabo con ésteres de forbol han demostrado que los dominios C1a y C1b desempeñan un papel equivalente en la traslocación a la membrana inducida por el PMA (Bogi y col., 1998). Estos resultados aparentemente contradictorios con los expuestos anteriormente, apoyan la hipótesis de que el DAG y los ésteres de forbol tienen afinidades distintas por cada dominio C1 (Medkova y Cho, 1999). Esta selectividad del dominio C1a de la PKCα parece deberse a su
capacidad para penetrar en la membrana e interaccionar con el DAG que está parcialmente inmerso en ella (Medkova y Cho, 1999).
El dominio C1 aislado posee un extraordinario poder de penetración en comparación con la proteína entera, lo cual sugiere que en la proteína completa el resto de dominios limitan el poder de penetración de los dominios C1 (Medkova y Cho, 1999). Hay algunas evidencias que proponen que existe cierta relación del dominio C1 con otras zonas de la PKC. Así, estudios recientes de mutagénesis dirigida han demostrado que la mutación del residuo de Asp55 a Ala produjo la reducción en la especificidad por la fosfatidilserina en ensayos de unión y actividad, pero una mayor afinidad por vesículas, mayor actividad y mayor poder de penetración que la proteína tipo silvestre en condiciones de no activación (con fosfatidilglicerol y en ausencia de Ca2+). Esto sugiere que el Asp55 está implicado en la unión del dominio C1a con otra zona de la PKCα (Bittova y col., 2001).
Las isoenzimas atípicas de la PKC contienen un dominio C1 diferente, con un solo motivo de “dedos de zinc”, el cual no es capaz de enlazar ésteres de forbol o DAG (Akimoto y col., 1994). Se ha observado que este dominio C1 atípico carece de los residuos hidrofílicos necesarios para enlazar esos ligandos específicos y formar la superficie hidrofóbica en el sitio de unión de ligando (Mott y col., 1996) y muestra más homología con el dominio C1a que con el C1b de las isoenzimas clásicas y nuevas de la PKC (Szallasi y col., 1996). La función de los dominios C1 en las isoenzimas PKC que no unen DAG o ésteres de forbol se desconoce hasta ahora.
Los dominios C1 también están presentes en otras proteínas de mamífero además de en la PKC. En algunas de ellas, como las quimerinas o las proteínas Ras liberadoras de guanilo (ras-GRP), los dominios C1 están presentes en una sola copia y unen ésteres de forbol y DAG (Caloca y col., 1994; Ebinu y col., 1998; Kazaniet, 2000), quedando dentro del grupo de los dominios C1 típicos. En otros casos, como ocurre con la proteína Raf-1 o en la quinasa supresora de Ras (KSR), el dominio C1 no une ni DAG ni PMA, por lo que se conoce también como dominio C1 atípico (Luo y col., 1997; Newton, 1998; Zhuo y col., 2002). Un caso curioso es la proteína diacilglicerol quinasa (DAG quinasa), la cual contiene un dominio C1 que inicialmente parecía ser independiente de DAG y PMA (Sakane y col., 1996;
Newton, 1998), aunque recientemente se ha demostrado que interacciona con ésteres de forbol (Sindo y col., 2001).
Por otro lado, los ésteres de forbol se pueden unir a otras proteínas además de la PKC para activarlas. De esta forma, por ejemplo, el PMA estimula la actividad de las proteínas GAP (proteínas que activan a GTPasa) hacia la GTPasa Rac (Ahmed y col., 1993).