El dominio NBzdR se une y reprime al promotor P N

Para verificar si la proteína NBzdR es un verdadero dominio funcional y mantiene su capacidad de reprimir la transcripción del promotor PN se realizaron

abordajes in vitro e in vivo de interacción con PN utilizando NBzdR y NBzdRL (Fig.

29). La utilización de estas dos variantes tuvo como objetivo determinar la influencia del linker tanto en el proceso de dimerización como en la interacción con el DNA. Los ensayos in vitro de retardo en gel demostraron la capacidad de ambas proteínas, NBzdR y NBzdRL, de unirse al promotor PN (Fig. 30A). Sin embargo,

también se pueden apreciar ciertas diferencias en relación a la afinidad por la sonda

PN, ya que con la proteína NBzdR es necesario alcanzar una concentración de 100

nM para retardar totalmente la sonda PN, mientras que con NBzdRL o con BzdR se

observa un retardo casi total de la sonda a una concentración de 50 nM. Otra notable diferencia entre la proteína parental BzdR y el dominio NBzdR es el número de complejos proteína-DNA formados. Mientras que la proteína BzdR da lugar a un único complejo, tanto NBzdR como NBzdRL dan lugar a, al menos, tres complejos, lo que podría reflejar diferencias en la cooperatividad de la unión de las proteínas a las tres cajas operadoras del promotor PN.

Resultados

Figura 30. Unión de las proteínas purificadas NBzdR, NBzdRL y BzdR al promotor PN. (A) Unión de las proteínas al promotor PN mediante ensayos de retardo en gel realizados como se indica en el apartado 7.2 de Materiales y Métodos. En todos los casos, en la calle 1 se cargó sonda PN obtenida como se indica en el apartado 7.1 de Materiales y Métodos, y en las calles 2-8 se añadieron concentraciones crecientes 1, 2, 5, 10, 25, 50 y 100 nM, respectivamente, de las proteínas purificadas. PN representa la sonda libre y C representa el complejo, o complejos, formados entre la proteína y el promotor PN. (B) Ensayo de protección frente a la digestión por DNasa I realizado como se indica en el apartado 7.3 de Materiales y Métodos. En la calle 0 se cargó sonda PN en ausencia de proteínas. En las calles 1-3, 4-6 y 7-9 se añadieron 50, 100 y 200 nM de las proteínas His6-NBzdR, His6-NBzdRL e His6-BzdR purificadas,

respectivamente. Calle AG: reacción de secuenciación del promotor PN mediante el método de Maxam y Gilbert. A la izquierda se indican con corchetes las tres regiones operadoras (I, II y III) protegidas por las proteínas y a la derecha las cajas -35, -10 y el +1 del promotor PN.

Con el fin de profundizar en el estudio de la unión de NBzdR al promotor PN

se llevaron a cabo ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. Tal y como se puede observar en la Figura 30B, la proteína NBzdR protege las mismas tres cajas operadoras descritas para BzdR (Barragán et al., 2005), si bien la caja operadora I no está completamente protegida por NBzdR a las concentraciones de proteína usadas en el ensayo. Este resultado no puede ser explicado por la diferencia volumétrica entre BzdR y NBzdR, ya que la proteína NBzdRL, de volumen similar a NBzdR, fue capaz de proteger totalmente la caja operadora I, al igual que sucede con BzdR, con lo que la causa de la menor protección del operador I de PN por

NBzdR parece deberse a la ausencia del linker en el regulador, el cual podría estar implicado en la correcta formación de los dímeros de proteína, lo que incrementaría la afinidad por el DNA y permitiría una protección más extensa de las cajas operadoras.

Los ensayos de expresión in vivo demostraron la capacidad de ambas proteínas, NBzdR y NBzdRL, de unirse y reprimir la actividad del promotor PN con

una efectividad similar a la obtenida con BzdR. Dichos ensayos se llevaron a cabo Figura 31. Represión ejercida por las proteínas NBzdR, NBzdRL y BzdR sobre el promotor PN. (A) Ensayos in vivo. La cepa E. coli MC4100-T1, que incorpora en cromosoma la fusión PN::lacZ (Tabla 4), fue transformada con los plásmidos pCK01-BzdR, pCK01-NBzdR ó pCK01-NBzdRL, que expresan las proteínas His6-BzdR, His6-NBzdR e His6-NBzdRL, respectivamente (Tabla 5). Las cepas fueron cultivadas

en condiciones anaeróbicas y en medio LB a 30ºC, hasta que alcanzaron una A600 de 0.5. Posteriormente,

se ensayó su actividad β-galactosidasa, tal y como se detalla en el apartado 6.1.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en tres experimentos separados e independientes y presentaron una desviación estándar menor del 10%. (B) Ensayos de transcripción in vitro del promotor PN. Reacciones de transcripción in vitro de múltiples rondas utilizando como molde el plásmido pJCD-PN, que incluye el promotor PN (Tabla 5). Todas las reacciones fueron llevadas a cabo en presencia de RNAP de E. coli 50 nM y proteína purificada His6-Fnr*

20 nM, como se detalla en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. Además, se añadió proteína purificada His6-BzdR, His6-NBzdR ó His6-NBzdRL 40 nM, en ausencia o presencia de benzoil-CoA 2 mM, según se

indica. 4000 3000 2000 1000 0 A c tiv idad β- g al ac tos ida sa (U ni da de s M ill er ) P_N BzdR P_N NBzdR P_N P_N NBzdRL P_N lacZ P_N lacZ 0 50 100 – BzdR T ran scrip ci ón in v itro (U n ida de s a rbi tr ar ia s) NBzdR 75 25 NBzdRL NBzdRL + Benzoil

+ Benzoil--CoACoA

A

B

NBzdR BzdR

Resultados

midiendo la actividad β-galactosidasa de la fusión traduccional PN::lacZ en E. coli

(Fig. 31A). Los ensayos de transcripción in vitro también apoyaron estos resultados, como se puede observar en la Figura 31B, donde NBzdRL muestra un nivel de represión del promotor PN semejante al obtenido con la proteína parental BzdR.

Además, se pudo demostrar que únicamente la proteína BzdR presenta la capacidad de responder al inductor, el benzoil-CoA, al contrario de lo que sucede con NBzdRL, que mantiene reprimido el promotor PN constitutivamente al no poseer el

dominio efector CBzdR que presumiblemente une benzoil-CoA. Con la proteína NBzdR se obtuvieron los mismos resultados que con NBzdRL, tal y como se puede apreciar en la Figura 31B.

Estos datos demuestran la funcionalidad del dominio NBzdR y su independencia respecto del dominio CBzdR, siendo capaz de unirse eficazmente al promotor PN y reprimir constitutivamente su actividad.